新疆南疆羊蜱蝇基于12S rDNA，16S rDNA和 18S rDNA基因的分子生物学鉴定

何 波,李 飞,2,李凯瑞,张路瑶,3,赵 丽,4,刘永宏,4

(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000；3.巴里坤哈萨克自治县畜牧兽医工作站，新疆哈密 839200；4.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

羊蜱蝇(Melophagusovinus)是双翅目、虱蝇科、蜱蝇属一种无翅的体外吸血寄生虫[1]，无平衡棒，体表呈革质，密被细毛；头部短小阔扁，无单眼，复眼小，触角极短，具有刺吸式口器；胸部不分节，有3对足，末端有发达的爪及4对气门；腹部不分节，雌虫腹部大而圆,末端凹陷，雄虫腹部小，末端凸出[2]。

绵羊通常被认为是羊蜱蝇主要的终末宿主，但是羊蜱蝇已经在一系列家养和野生动物甚至人上被发现，例如：山羊[3]、欧洲野牛[4]、红狐[5]和人[6]等。羊蜱蝇寄生于绵羊时，宿主会因为叮咬引起痛痒不安和炎症，继而通过啃咬和摩擦体表来缓解羊蜱蝇带来的刺激，最终导致羊毛脱落和皮肤损伤，增加绵羊皮肤蝇蛆病的感染风险[7]，同时，被感染的羊会逐渐消瘦及羊毛生长缓慢[8]，从而造成经济损失。此外，羊蜱蝇还是多种病原体的传播媒介，已被报道并证实的病原体有蓝舌病病毒[9]、巴尔通氏体[10]、立克次氏体[11]、杀雄菌[12]、沃尔巴克氏体[12]、绵羊无浆体[13]、包柔氏螺旋体[14]以及羊锥虫[1]等，因此对羊蜱蝇的研究具有积极意义。通过研究羊蜱蝇12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA基因，确定羊蜱蝇与其他绵羊体外寄生虫在分子生物学上的区别。仅依靠形态学鉴定羊蜱蝇可能会存在一定误差，本研究从新疆南疆库车县某羊场收集羊蜱蝇，结合形态学和分子生物学方法对羊蜱蝇进行准确鉴定，为虫媒病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品 羊蜱蝇采自新疆南疆库车县某羊场绵羊体表，采集后立即送往塔里木大学畜牧科技重点实验室，分别于离心管中-20 ℃保存和φ=75% 乙醇保存。

1.1.2 引物 参照文献中的方法进行引物设计：12S rDNA基因采用通用引物12S-F和12S-R[15]，预期片段大小为320 bp；16S rDNA基因采用通用引物16S-F和16S-R[16],预期片段大小为455 bp； 18S rDNA基因引物参照GenBank中已登录的羊蜱蝇 18S rDNA序列，应用Primer premier 5.0进行设计,预期片段大小为619 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1。

表1 引物序列信息Table 1 The sequence information of primers

1.1.3 主要试剂及仪器 TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(Code No.9765)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)(Code No.R004A)和DL2000 DNA marker(Code No.3427A)，购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR仪(TC-5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷冻离心机(R134a，Hermetically sealed refigeration system)，电泳仪(DYY-12，购自北京市六一仪器厂)，凝胶成像仪(BIO-RADGelDocXR，购自美国博乐公司)。

1.2 方 法

1.2.1 羊蜱蝇的形态学鉴定 从乙醇中取出样品，应用体视显微镜观察羊蜱蝇的头、胸、腹、足、口器等形态特征，对羊蜱蝇进行形态学初步鉴定。

1.2.2 羊蜱蝇DNA提取 于-20 ℃冰箱中取出样品，蒸馏水漂洗 3 次后，按照TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书提取羊蜱蝇基因组DNA。

1.2.3 基因扩增及电泳 将所提取到的羊蜱蝇DNA为模板，分别扩增12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA基因片段，PCR扩增体系50 μL：基因组DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq25 μL，双蒸水22 μL。PCR反应程序：12S rDNA为94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性15 s，51 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5个循环；94 ℃ 变性15 s，53 ℃ 退火30 s，70 ℃ 延伸30 s，25个循环；70 ℃ 延伸5 min。16S rDNA为94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，49 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5个循环；94 ℃ 变性30 s，47 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5个循环；94 ℃ 变性30 s，45 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5个循环；94 ℃ 变性30 s，49 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，25个循环；68 ℃ 延伸5 min。 18S rDNA为95 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测后，产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 序列分析 将测序结果进行Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)相似性比对，应用MEGA 5.0的Clustal W进行核酸序列比对，进一步检查对齐，计算遗传距离，应用邻位相连法(Neighbor-Joining method)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

由图1和图2可知，羊蜱蝇无翅，体表呈革质，密被细毛。体躯分为头、胸、腹 3 部分，头短而宽，与胸部紧密相连，具有刺吸式口器，胸部暗褐色，具有 3 对足，末端有粗壮的爪。雌性羊蜱蝇腹部大而圆，末端凹陷；雄性羊蜱蝇腹部较小而圆，末端有突出的长锥状阴茎。

图1 雌性羊蜱蝇腹面Fig.1 Ventral side of female Melophagusovinus

图2 雄性羊蜱蝇腹面Fig.2 Ventral side of male Melophagusovinus

2.2 PCR扩增及测序

对形态学鉴定为羊蜱蝇的样本(n=4)进行基因组DNA提取，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测均可得到目的条带，与预期片段大小一致(图3)。测序共获得羊蜱蝇12S rDNA序列2条、16S rDNA序列2条， 18S rDNA序列4条。结果上传GenBank数据库，并获得序列登录号：MH102302、MH102303(12S rDNA)；MH102311、MH119054(16S rDNA)；MH119055-MH119058(18S rDNA)。

a：12S rDNA；b：16S rDNA；c：18S rDNA；M.DL2000 DNA marker；1～4.PCR产物 PCR products

2.3 系统进化与遗传距离分析

2.3.1 12S rDNA序列分析 Blast结果发现：试验获得的序列与云南2016年上传的羊蜱蝇序列(GenBank登录号：KU664532.1)的相似性为100%，与日本2011年提交的鹿虱蝇序列的相似性为94%(GenBank登录号：AB632589.1)。

2.3.2 16S rDNA序列分析 Blast结果发现：试验所得序列与丹麦2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的羊蜱蝇序列的相似性均为99%(GenBank登录号分别EF531104.1、MF495941.1和KY224148.1)，与捷克2017年提交的颈利虱蝇和鹿虱蝇序列相似性分别为92%和91%(GenBank登录号为MF495940.1和MF495939.1)。

从GenBank数据库中选取已知相应虱蝇总科蝇类的基因序列，包括舌蝇科、虱蝇科和蛛虱蝇科，同时另选择硬蜱和软蜱基因序列各1条作为对照，利用MEGA 5.0软件，基于K2P 遗传距离用邻位相接法构建系统进化树。由图4可知，基于16S rDNA序列进化树主要分为虱蝇总科和蜱，同时试验所得样品3和4与羊蜱蝇划在同一小分支。经计算，本试验所获得的羊蜱蝇序列和GenBank数据库已知羊蜱蝇序列的种内遗传距离为0.7%～2.3%，与虱蝇科其他属种的种间遗传距离为10.1%～16.4%。种内遗传距离和种间遗传距离没有交叠，结合NJ进化树和遗传距离分析，认为16S rDNA序列可以用于羊蜱蝇的鉴定。

2.3.3 18S rDNA序列分析 Blast结果发现：试验所得序列与新疆2016年提交的4条羊蜱蝇序列的相似性为99%(GenBank登录号为KY224149.1、KX506727.1、KX506728.1和KX506729.1)，与捷克2000年提交的颈利虱蝇的相似性为98%(GenBank登录号为AF322426.1)，与美国2012年和加拿大1998年提交的东非舌蝇和鸟虱蝇的相似性分别为97%和96%(GenBank登录号分别为KC177312.1和AF073888.1)。

由图5可知，进化树主要分为 2 支：1支以虱蝇总科为主，1支以蜱为主，其中试验所得羊蜱蝇样品均与已知羊蜱蝇划为一小支。经计算，本试验所得序列与GenBank数据库中已知羊蜱蝇序列的种内遗传距离为0，与虱蝇科其他属种的种间遗传距离为1.7%～9%。种内遗传距离和种间遗传距离没有交叠，结合NJ进化树和遗传距离分析，认为 18S rDNA序列可以用于羊蜱蝇的鉴定。

图4 基于羊蜱蝇16S rDNA的NJ系统进化树Fig.4 NJ phylogenetic tree based on 16S rDNA of Melophagusovinus

图5 基于羊蜱蝇 18S rDNA的NJ系统进化树Fig.5 NJ phylogenetic tree based on 18S rDNA of Melophagusovinus

3 讨 论

羊蜱蝇地理分布广，原产于欧洲大部分地区、非洲西北部、蒙古和印度北部，后引入到肯尼亚、南非、日本、澳大利亚、新西兰和北美洲多数地区[11]。在中国，目前仅有新疆[10]、青海[17]、辽宁[18]、甘肃[2,12]等少数地区报道羊蜱蝇寄生于绵羊或藏羚羊；另外，山东[19]、浙江[20]等检疫口岸在进口羊、羊皮和羊毛中检出羊蜱蝇成虫或蛹，存在传播病原体的潜在危险。本试验通过对羊蜱蝇的形态学初步鉴定和分子生物学鉴定发现新疆存在羊蜱蝇。

羊蜱蝇外观与蜱相似，且关于羊蜱蝇形态学的报道相对较少，本试验应用体视显微镜对羊蜱蝇进行观察，发现其特征与段德勇[2]关于绵羊虱蝇形态学的描述大体一致，但还是不能做出结论，因此采用分子生物学方法鉴定。相比于传统的形态学鉴定，分子生物学鉴定易于操作，结果更加准确。

本试验结果表明羊蜱蝇的 3 种基因序列均可以通过PCR测序获得，16S rDNA和 18S rDNA已被广泛用于生物的属种鉴定[21]，例如：韩剑等[22]利用植原体16S rDNA对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株做出准确鉴定。相比于16S rDNA和 18S rDNA，羊蜱蝇12S rDNA基因很少被用于属种的鉴定，但本试验所获得的 2 条12S rDNA基因序列与云南2016年提交的羊蜱蝇12S rDNA序列的相似性为100%，可以作为16S rDNA和 18S rDNA基因序列分析结果的一个补充，也为羊蜱蝇的分子生物学鉴定提供参考。

根据MEGA 5.0软件的K2P 遗传距离采用NJ法构建系统进化树，结果表明基于16S rDNA和 18S rDNA基因序列的羊蜱蝇种内和种间遗传距离没有交叠，其最小种间遗传距离与最大种内距离的差值分别为7.8%和1.7%，本试验所用羊蜱蝇样本能很好地与其他虱蝇科物种聚类，并且能与已知羊蜱蝇划为同一小支。结果表明，基于12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA序列的分子生物学方法可以用羊蜱蝇的准确鉴定，有助于掌握羊蜱蝇在国内的种群分布，为防止潜在的病原体传播奠定基础。