生防因子间型假丝酵母C410液体酵母保存研究

李若晨 张静 杨龙 李国庆

摘要：对生防菌间型假丝酵母（Candida intermedia）C410菌株的液体酵母保存方法进行研究。结果表明，当保存起始细胞浓度为2×109个细胞/mL，4 ℃恒温保存，在磷酸缓冲液PPB中添加5%海藻糖和1 mmol/L维生素C时，能够使C410酵母细胞保持高效活力持续90 d以上。对保存90 d的液体酵母防效进行测定，发现其防治效果与新鲜酵母细胞悬浮液的防效相当，都能抑制番茄灰霉病菌的生长繁殖，保持番茄果实品质完整。

关键词：灰霉病；生物防治；间型假丝酵母（Candida intermedia）C410；液体酵母

中图分类号：S436.412.1+3 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）16-0066-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.015 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Preservation of Liquid Formulation of the Biocontrol Agent Candida intermedia C410

LI Ruo-chen，ZHANG Jing，YANG Long，LI Guo-qing

（College of Plant Science & Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： The preservation of liquid formulation of the biocontrol agent Candida intermedia C410 was primarily explored. Results showed that， while the initial preserving concentration was 2×109 cells/mL， storage temperature was 4 ℃， liquid formulation of C410 with high viability of cells were phosphate buffers supplemented with 5% trehalose and 1 mmol/L ascorbic acid. The liquid formulation kept high viability of yeast cells for more than 90 days. Suspensions of liquid formulation after 90 days and fresh yeast cells were tested against B. cinerea on tomato fruits， both suspensions exhibited prospective biocontrol effect， gray mould of tomato was inhibited while the quality of tomato fruits maintain completely good.

Key words： gray mold； biocontrol； Candida intermedia C410； liquid formulation

酵母菌是一類结构简单的单细胞微生物，广泛存在于自然生态系统中，如植物的叶片、花瓣、果实表面、土壤及植物根围、腐烂的植物组织、海洋等生态环境中。人类对酵母菌的开发利用可以追溯至 4 000年前，至今在多个领域有生产应用[1]。利用酵母菌作为生防因子来防治植物病害的发生与蔓延是近年来国内外研究热点，迄今已发现了30多种酵母菌能够有效生防辣椒、番茄、葡萄、草莓、桃、柑橘等果蔬上由不同病原菌引起的腐烂[2-6]。

酵母菌作为生防菌的潜力已被研究者深入试验评估，但其商业化应用发展较为缓慢，目前主要有液体酵母和干酵母两类制剂。制剂“Aspire”主要成分为Candida oleophila I-182，以Cryptococcus albidus为基础制成Yield Plus，将Metschnikowia fructicola商业化为Shemer等，这些制剂主要作为保鲜剂对果蔬进行保鲜处理。

前人研究证明间型假丝酵母（Candida intermedia）C410菌株对贮藏期草莓果实灰霉病有明显的防治效果[7，8]。通过室内防效、保护地防效评估发现生防菌C410对番茄灰霉病有一定的防病潜力，该生防菌田间喷雾处理减轻了保护地番茄灰霉病病害的发生[9]。同时在番茄植株盛花期，低浓度和高浓度C410细胞悬浮液花瓣喷雾处理后，酵母细胞能适应保护地环境，在花瓣微环境中占有一定的空间优势，可以存活5 d以上直至花瓣凋落[9]。因此可以将间型假丝酵母C410菌株研发制备成生物菌剂在田间推广应用。

液体酵母是生防菌剂制备的理想剂型，方法简单，容易操作，酵母细胞有效成分在制备过程中损失较少。前人制备Candida sake和Pichia anomala的液体酵母时在磷酸缓冲液中添加海藻糖或乳糖使酵母细胞能够保持高效活力[10，11]。本试验以C410酵母细胞为有效菌剂成分，筛选适合酵母细胞存活的液体酵母保存方法，并对保存的液体酵母生防稳定性进行进一步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株培养 将经活化后新培养的灰霉病菌（Botrytis cinerea）的新鲜菌丝块转至PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）平板中央，20 ℃黑暗培养 14 d，得到试验用分生孢子。

酵母菌株C410细胞保存于20%甘油中，-80 ℃储存。使用前用接种环蘸取少许菌液划线于YPDA（酵母提取浸粉蛋白胨葡萄糖琼脂培养基）平板上进行活化（20 ℃，3～5 d），新鲜菌体再转入100 mL YPD液体培养基20 ℃，摇培3 d作为种子发酵液待用。

1.1.2 C410细胞悬浮液的制备 从100 mL YPD（酵母提取浸粉蛋白胨葡萄糖培养液）液体培养基中吸取200 μL C410种子发酵液至YPDA平板上，用涂布器涂匀吹干后20 ℃黑暗培养发酵，3 d后将平板上的酵母细胞用灭菌水洗下，即为C410细胞悬浮液。

1.1.3 培养基与试剂 1）PDA：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g，去离子水1 000 mL。

2）YPDA：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取浸粉10 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL。

3）YPD：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取浸粉10 g，去离子水1 000 mL。

4）PPB（磷酸缓冲液）：1 mol/L K2HPO4 27.8 mL，1 mol/L KH2PO4 72.2 mL，混合均匀后稀释至50 mmol/L。

5）维生素C（抗坏血酸）：1.76 g粉剂溶于100 mL去离子水，并用细菌过滤器进行过滤处理，最后根据试验处理进行梯度稀释至1 mmol/L。

6）其他试剂：甘油、海藻糖。

1.2 方法

1.2.1 液体酵母有效成分酵母菌体的获取 制备C410细胞悬浮液，于4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，弃上清并将酵母细胞重悬浮于50 mmol/mL磷酸缓冲液PPB（pH 6.4）中，清洗后4 ℃条件下8 000 r/min再次离心10 min，弃上清，得到液体酵母制备所需有效成分酵母菌体。

1.2.2 液体酵母保存浓度的确定 将离心得到的酵母菌体重悬浮于下列不同处理中，①对照PPB；②含10%甘油的PPB；③含20%甘油的PPB；④含10%甘油及维生素C（1 mmol/L）的PPB；⑤含20%甘油及维生素C（1 mmol/L）的PPB；⑥含1%海藻糖的PPB；⑦含5%海藻糖的PPB；⑧含1%海藻糖及維生素C（1 mmol/L）的PPB；⑨含5%海藻糖及维生素C（1 mmol/L）的PPB。

利用血球计数板将上述各处理的酵母细胞起始保存浓度调整至2×109个细胞/mL和2×1010个细胞/mL，置于20 ℃培养箱恒温保存。10 d后分别对各处理进行取样梯度稀释，用移液器分别取200 μL稀释样品涂于YPDA培养基平板上，超净工作台中吹干后置于20 ℃恒温培养箱培养，3 d后对平板中的酵母菌落进行计数。

1.2.3 液体酵母保存温度的确定 液体酵母各处理方法同“1.2.2”，利用血球计数板将各处理的酵母细胞起始保存浓度调整至2×109个细胞/mL，分别置于4 ℃和20 ℃恒温保存，10、30、90 d后分别对各处理进行取样梯度稀释。取200 μL稀释样品涂于YPDA培养基平板上，超净工作台中吹干，置于20 ℃恒温培养箱培养，3 d后对平板中的酵母菌落进行计数。

1.2.4 液体酵母储存90 d后的防效检测 对储存90 d的液体酵母取样稀释，利用血球计数板将各处理液体酵母细胞浓度调至3×107个细胞/mL；同时制备培养3 d的新鲜C410细胞悬浮液，利用血球计数板使其细胞浓度达到3×107个细胞/mL。用去离子水将培养14 d的灰葡萄孢分生孢子从培养基平板上洗下，并用两层擦镜纸过滤，借助血球计数板将其调至终浓度2×106个孢子/mL后备用。

从超市购买新鲜的红樱桃番茄，去离子水清洗表面，并用75%乙醇表面消毒30 s，然后用去离子水漂洗3次去除残留乙醇，最后将番茄果实置于吸水纸上自然晾干。在每一番茄表面中心处制造长2 mm、宽2 mm、深2 mm的人工伤口，将直径5 mm灭菌滤纸片浸蘸下列不同的C410酵母细胞悬浮液后覆盖于番茄伤口处：①新鲜酵母细胞悬浮液（FC）；②5%海藻糖储存90 d的液体酵母（5%T）；③5%海藻糖及维生素C（1 mmol/L）储存90 d的液体酵母（5%T+Vc）；④对照处理（CK）。用移液器滴加20 μL配制好的灰霉分生孢子液于滤纸片上，每处理20个番茄果实，重复2次，对照处理为覆盖仅滴加20 μL灰霉分生孢子液的湿润滤纸片。

将处理好的番茄置于铺有湿润吸水纸的塑料盒内，封口后将盒子置于20 ℃培养箱，7 d后观察记录结果。根据各果实发病情况，将单果发病程度依9个等级分别进行记录，分级标准如下[7]。0级，果实完全不发病；1 级，发病面积≤整果面积的1/8；2级，发病面积≤整果面积的1/4；3级，发病面积≤整果面积的3/8；4级，发病面积≤整果面积的1/2；5级，发病面积≤整果面积的5/8；6级，发病面积≤整果面积的3/4；7级，发病面积≤整果面积的7/8；8级，整果发病。

1.3 数据统计

使用SAS 8.0统计分析软件分别对上述试验的各项数据进行方差分析（ANOVA）。采用Duncan氏新复极差法比较各试验不同处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 C410液体酵母保存浓度的测定

20 ℃恒温保存10 d，不同保存浓度下各处理的C410液体酵母细胞存活数量呈现不同态势（表1）。当起始保存浓度为2×109个细胞/mL时，各处理中添加甘油保护剂的液体酵母活细胞数量下降一个数量级至108个细胞/mL，混合添加甘油和维生素C的液体酵母活细胞数量同样下降到108个细胞/mL，而添加1%、5%海藻糖或添加1%、5%海藻糖及1 mmol/L 维生素C的处理液体酵母活细胞数量仍能维持在109个细胞/mL数量级，添加5%海藻糖及1 mmol/L维生素C的C410液体酵母细胞存活率为90%，显著高于其他处理。当起始保存浓度为2×1010个细胞/mL时，未发现较好处理使酵母活细胞数量能维持1010个细胞/mL数量级，各处理酵母活细胞数量都下降一个数量级，C410液体酵母细胞存活率较低。

2.2 C410液體酵母细胞保存温度的测定

采用2×109个细胞/mL起始保存浓度对各处理进行保存温度的研究。由表2可知，20 ℃恒温保存时，单独添加甘油保护剂的处理和混合添加甘油、维生素C的处理中C410液体酵母细胞存活状态较差，保存10 d C410液体酵母活细胞数量由2×109个细胞/mL下降至108个细胞/mL数量级，保存30 d C410液体酵母活细胞数量下降至107个细胞/mL数量级，最高存活率只有1.6%，YPDA平板上能长出丝状真菌菌落或细菌菌落。保存90 d各处理污染较严重，未检测。相同处理在4 ℃恒温保存时C410液体酵母细胞存活相对20 ℃恒温保存情况较好，保存10和30 d活细胞数量仍能稳定维持在2×109个细胞/mL左右，保存90 d液体酵母细胞存活数量出现下滑，C410液体酵母活细胞数量下降至108个细胞/mL数量级。

相比甘油保护剂配方，单独添加海藻糖或混合添加海藻糖、维生素C能使C410液体酵母细胞存活更好。20 ℃恒温保存10 d，各处理能检测到109个细胞/mL以上C410液体酵母活细胞，保存30 d只添加1%海藻糖的处理检测到9.8×108个细胞/mL左右活细胞，而其他处理液体酵母活细胞数量在109个细胞/mL以上。最高C410液体酵母细胞存活率为80%，与其他处理相比差异显著，YPDA平板上部分处理能检测到丝状真菌菌落。4 ℃恒温保存时，10 d C410液体酵母菌能保持接近100%的存活率，存活的酵母菌浓度与起始保存浓度2×109个细胞/mL相当，保存30和90 d单独添加海藻糖或混合添加海藻糖、维生素C的处理C410液体酵母活细胞数量可以维持在1.5×109个细胞/mL以上，细胞存活率80%以上。

2.3 C410液体酵母储存90 d的防效

由上述试验结果可知，单独添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L维生素C显示出保存酵母活细胞的优势，因此比较这两种液体酵母储存90 d对番茄灰霉病的防治效果。

如图1所示，接种7 d，对照（CK）只滴加灰霉分生孢子液的番茄果实在接种点周围长满灰白色菌丝，部分可见灰色分生孢子形成，番茄果皮暗红色，果实变软塌陷，平均病情严重度达到3.6；单独添加5%海藻糖（5%T）或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L维生素C（5%T+VC）的液体酵母滴加至番茄果实上后，接种点处未见大量灰色菌丝形成，少数伤口处呈黄褐色坏死状，果实几乎不发病，与新鲜酵母细胞悬浮液（FC）的防效相当，平均病情严重度小于1.0。

3 讨论

干酵母制剂和液体酵母是两种重要的保存酵母细胞活力的制备剂型，干酵母货架期长久，可以使酵母细胞活力保持2年之久，耐高温储存，污染概率较小，但脱水和复水过程造成大量有效成分酵母细胞的死亡[12，13]；液体酵母制备方法简单，操作简易，制备过程中酵母细胞有效成分损失较少，是理想的生防菌剂制备剂型。

前人研究中，制备液体酵母时在磷酸缓冲液中添加海藻糖或乳糖能够使Candida sake和Pichia anomala的酵母细胞保持高效活力[10，11]。本试验筛选出了对C410酵母细胞存活影响较小的保存方法，当保存起始细胞浓度为2×109个细胞/mL，保存温度为4 ℃恒温，单独添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖和1 mmol/L维生素C酵母活细胞数量可以维持在1.5×109个细胞/mL以上，适合制备酵母菌剂。

海藻糖可以作为生物制品制备中的优良保护剂，在胞外可在酵母细胞表面形成独特的保护膜，有效保护细胞膜上的蛋白分子使其避免失活变性，维持正常功能运作；在细胞内部，海藻糖可以增加细胞质的黏稠度，改变胞内水势，延缓细胞代谢，使细胞稳定存活[14]。本研究中添加5%海藻糖提高了C410酵母细胞的存活能力。

液体酵母保存过程中活性氧的生成是影响酵母细胞存活的重要因子，抗坏血酸（维生素C）是重要的抗氧化剂，在食品工业中作为食品添加剂广泛应用。在本研究中添加5%海藻糖同时混合1 mmol/L维生素C可延长酵母细胞存活时间，4 ℃恒温保存90 d，酵母存活率维持在100%左右，180 d后还能检测到109个细胞/mL的酵母活细胞，这可能与维生素C消除制剂中的活性氧保护细胞不受损害有关。生防制剂最终将应用到大田，紫外线伤害会阻碍生防因子的田间存活，维生素C能够作为紫外线保护剂提高生防菌种群在田间的存活能力，因此有必要在液体酵母中添加维生素C消除制剂中的活性氧同时减少田间紫外线的伤害。因此，混合添加5%海藻糖及1 mmol/L维生素C的配方优于单独添加5%海藻糖的处理。

单独添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L维生素C的优势液体酵母储存90 d的酵母菌对番茄灰霉病的防治效果显示，这两种方式保存的液体酵母防治效果与新鲜酵母细胞悬浮液的防效相当，均能抑制番茄灰霉病菌的生长繁殖，保持番茄果实品质完整。田间存在各种复杂的环境因素，后期有必要对优势处理的田间防效稳定性进行试验检测，为酵母菌C410田间应用提供有效参考依据。

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