快速溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法同时测定土壤中有机氯及有机磷农药

宋晓娟, 贺心然,2*, 尹明明, 万延延

(1. 连云港市环境监测中心站, 江苏 连云港 222001; 2. 河海大学环境学院, 江苏 南京 210098)

有机氯(organochlorine pesticides, OCPs)和有机磷(organophosphorus pesticides, OPPs)均是环境监测中备受关注的农药类物质。OCPs是典型的持久性有机污染物,自20世纪初合成以来,曾大量用于农业生产,因其具有强毒性和生物累积性,相继被各国禁用,中国自1986年全面禁用,但时至今日仍可从各种环境介质中检出该类物质[1-3]。OPPs具有广谱、高效、品种多等特点,在我国已有30多年的使用历史,其用量稳居各类农药之首[4,5]。

农药类物质释放进入环境后,首先遭受侵害的是土壤,建立快速、灵敏的检测方法,对于研究土壤中农药的污染水平、评价土壤环境质量具有重要意义。土壤中OCPs和OPPs的检测包括前处理和仪器分析两个环节。前处理方式有索氏提取、超声提取、微波提取、快速溶剂萃取(accelerated solvent extraction, ASE)等[6-9],除超声提取不适用于OPPs外[6],其他方式均可同时处理这两类物质,其中ASE具有提取速度快、溶剂消耗量少、自动化程度高等优势,近年来应用广泛[9-12],国内外很多标准方法也优先推荐这种前处理方式[8,13],但一般情况下,都只针对其中一类农药建立分析方法,若要同时研究两类农药,需要分两次进行处理。本研究根据两类物质的理化性质,对ASE萃取过程进行了优化,筛选出同时适合两类物质的萃取溶剂,实现两者的同时萃取,大大提高了环境监测的工作效率。

最常用的OCPs和OPPs仪器分析手段都是GC法,OCPs适合用电子捕获检测器进行分析[10,14,15],检出限可达10-5mg/kg[14], OPPs适合用氮磷检测器或火焰光度检测器进行分析[5,16,17],检出限可达10-4mg/kg[17]。GC法单独分析每类物质时,灵敏度较高,但因检测器的差异无法实现同时测量,且方法抗干扰能力不足,土壤基质比较复杂时,难以避免假阳性现象。相对而言,GC-MS法可以实现同时检测,并可通过离子碎片的筛选增强抗干扰能力,但质谱的灵敏度不如GC法高,全扫描条件下OCPs的检出限仅为10-2mg/kg[18]。针对以上问题,本研究选择GC-MS/MS法进行分析,一方面,可实现两类物质的同时检测,提高工作效率;另一方面,通过两级质谱的筛选,可降低背景,提高灵敏度,增强土壤中农药残留的分析能力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(7890B-7000C,美国Agilent公司);快速溶剂萃取仪(E-914,瑞士Buchi公司);全自动氮吹浓缩仪(TurboVap Ⅱ,美国Caliper公司);真空冷冻干燥机(TFD,韩国Ilshin公司);固相萃取仪(EluVac TM,德国LC-Tech公司)。

正己烷、丙酮、二氯甲烷(色谱纯,美国Fisher Scientific公司);乙酸乙酯(色谱纯,德国CNW公司);硅胶(Si)SPE小柱(1 g/6 mL)和Florisil SPE小柱(1 g/6 mL)(德国CNW公司);无水硫酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);硅藻土颗粒(30～40目)、石英砂颗粒(20～30目)(瑞士Buchi公司);实验用水(屈臣氏纯净水)。

分别用丙酮-正己烷(1∶1, v/v)溶液对标准溶液进行稀释,配成目标物中间使用液(8种OCPs+5种OPPs,质量浓度均为1 mg/L)、内标中间使用液(PHE-d10+CHR-d12,质量浓度均为4 mg/L)、替代物中间使用液(TCMX,质量浓度为1 mg/L),于4 ℃保存。

1.2 样品采集和预处理

采集表层土壤(0～20 cm)至洁净、棕色玻璃瓶中,采样瓶装满、装实,密封、避光、4 ℃以下冷藏,保存时间不超过10 d。取适量样品混匀,经-40 ℃冷冻干燥后,用研钵研磨,过250 μm金属网筛混匀后置于干燥器中备用。

准确称取10.0 g样品,均匀混入2.0 g硅藻土颗粒,置于专用的玻璃纤维滤筒中。萃取腔(80 mL)底部放置专用的玻璃纤维滤膜,然后铺一层石英砂颗粒,再放入玻璃纤维滤筒,同时加入10.0 μL替代物中间使用液(1 mg/L),之后再加入一定量的石英砂颗粒,直至石英砂距腔体顶部0.5～1.0 cm,最后用玻璃纤维滤膜封口,放入ASE仪中进行萃取,接收瓶体积为250 mL。

1.3 萃取与净化

1.3.1萃取

萃取溶剂:正己烷-丙酮(1∶1, v/v);载气(高纯氮气)压力:0.8 MPa;萃取温度:100 ℃;萃取池压强:10 MPa;预加热平衡时间:3 min;静态萃取时间:5 min;放气时间:2 min;循环次数:3次;总萃取时间:45 min。

表 1 有机氯农药、有机磷农药、2种内标及1种替代物的质谱参数

1.3.2净化

将1.3.1节所得的萃取液,通过装有无水硫酸钠的漏斗进行脱水,并用氮吹仪浓缩至1.0 mL。Si SPE小柱预先用15.0 mL正己烷活化,然后加入除水、浓缩后的萃取液,用1.0 mL正己烷清洗浓缩管,洗液全部转入Si SPE小柱,接着用正己烷淋洗小柱2次,每次用量1 mL。之后用15.0 mL正己烷-丙酮(1∶1, v/v)溶液进行洗脱,收集全部洗脱液,常温下用微弱氮气浓缩至0.5 mL左右,加入5.00 μL内标中间使用液(4 mg/L),最终用正己烷-丙酮(1∶1, v/v)溶液定容至1.0 mL,供分析用。

1.4 GC-MS/MS条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:250 ℃;载气:高纯氦气(纯度99.999% );流速:1.0 mL/min;进样量:1.0 μL;分流比:10∶1;程序升温:初始温度60 ℃,保持1 min,以40 ℃/min 升至120 ℃,再以5 ℃/min 升至310 ℃。

1.4.2质谱条件

离子源:电子轰击(EI)离子源;离子源温度:230 ℃;扫描方式:多级反应监测(MRM)模式;电离能量:70 eV;传输线温度:280 ℃;溶剂延迟时间:5 min;碰撞气(高纯氮气)流速:1.5 mL/min。目标物、内标及替代物的质谱参数见表1。

1.5 定性与定量

将1.1节配制的目标物和替代物中间使用液(1 mg/L),分别用精密注射器抽取1.00、5.00、10.0、20.0、50.0及100 μL,用丙酮-正己烷(1∶1, v/v)溶液稀释至1.0 mL,配制成质量浓度为1.00、5.00、10.0、20.0、50.0及100 μg/L 的系列标准溶液。配制过程中,每个质量浓度系列均加入5.00 μL内标中间使用液(4 mg/L),保证内标质量浓度均为20.0 μg/L。将该系列标准溶液按照1.4节的条件按质量浓度从低到高的顺序进样分析。通过保留时间和NIST谱库检索对目标物进行定性分析,采用内标法进行定量分析。

1.6 质控手段

(1)使用超高惰性衬管进行分析,保证DDT降解率不超过15% 。(2)每10个样品做1个空白试验,保证目标物含量不超过方法检出限。控制措施包括:彻底清洗萃取池、玻璃器皿;无水硫酸钠、石英砂、硅藻土等使用前于400 ℃烘4 h。(3)校准曲线中目标物相对响应因子的相对标准偏差小于20% 。每日测定校准曲线中间浓度点,与实际值的相对偏差小于20% ,否则重新绘制校准曲线。(4)每10个样品分析1个平行样品,相对偏差小于30% 。(5)每10个样品分析1个基质加标样品,回收率控制范围为50% ～140% 。(6)建立替代物回收控制图,计算平均回收率p及标准偏差s,保证替代物的回收率控制在p±3s之间。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1萃取溶剂的优化

土壤中目标物的回收率首先取决于萃取溶剂,根据相似相溶原理,主要使用正己烷对OCPs这类极性相对较弱的物质进行萃取[10,11],基质比较复杂时(如固废),偶尔也可用二氯甲烷等极性稍强的溶剂进行萃取[19,20]。而OPPs的极性相对更强一些,通常选择二氯甲烷、三氯甲烷等极性稍强的溶剂进行萃取[21]。为综合考虑两类物质的萃取效率,本研究共设置了3种溶剂组合:正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(1∶1, v/v)和二氯甲烷-丙酮(1∶1, v/v), 3种组合的极性逐渐增强,可以全面研究两类物质回收率的变化。此外,每种组合中加入丙酮还有助于去除土壤中残余的水分,减轻后续的除水负担。

图 1 萃取溶剂对有机氯农药和有机磷农药回收率的影响(n=3)Fig. 1 Effects of the extraction solvent on the recoveries of the OCPs and OPPs (n=3)

称取9份高温处理后的石英砂各10.0 g,分成3组,每组3个平行样,每个样品分别加入10.0 μL目标物和替代物的中间使用液(1 mg/L),分别使用3种溶剂组合进行萃取,其余条件同1.3节,不同溶剂对回收率的影响见图1。由图1可知,对于OPPs而言,使用极性稍强的溶剂,有利于提高回收率,3种溶剂组合中,二氯甲烷-丙酮(1∶1, v/v)的萃取效果最好,但OCPs的情况却相反,极性相对较弱的正己烷-丙酮(9∶1, v/v)回收效果最好,为保证两类物质均达到相对较好的回收率,本研究选择中等极性的正己烷-丙酮(1∶1, v/v)作为最终萃取溶剂。

2.1.2净化小柱的选择

土壤基质较为复杂,萃取结束后,通常都需要进行净化。根据已有报道[11,14,17,19,20],用于OCPs和OPPs的净化小柱主要包括Si SPE和Florisil SPE两种,因此本研究分别对这两种小柱的回收率进行了测试。

图 2 SPE小柱对有机氯农药和有机磷农药回收率的影响(n=3)Fig. 2 Effects of the SPE column on the recoveries of the OCPs and OPPs (n=3)

称取6份高温处理后的石英砂各10.0 g,分成2组,每组3个平行样品,每个样品分别加入10.0 μL目标物和替代物的中间使用液(1 mg/L),在1.3.1节的条件下进行萃取,随后分别使用两种小柱进行净化,净化条件同1.3.2节,两种小柱对回收率的影响见图2。由图2可知,两种小柱的净化效果均可满足质控要求。Si和Florisil对13种目标物的平均回收率分别是73.8%和73.7% ,总体效果差别不大。就每类物质而言,Si和Florisil对OCPs的平均回收率分别是74.0%和77.5% ,对OPPs的平均回收率分别是73.4%和67.7% ,其中Florisil对OCPs的净化回收相对较低,因此本研究最终选择Si SPE小柱对两类物质进行净化。

2.1.3洗脱液的优化

洗脱液会直接影响目标物的回收率:极性太弱,可能无法把待测组分完全洗脱下来;极性太强,可能会洗下一些更强保留的杂质组分。根据以往报道,一般选用正己烷-丙酮(9∶1, v/v)对OCPs进行洗脱[14,18],而选用极性较强的乙酸乙酯等溶剂对OPPs进行洗脱[17]。为综合研究两类物质的回收率,本研究设置了3种溶剂组合:正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(1∶1, v/v)和正己烷-乙酸乙酯(1∶1, v/v), 3种组合的极性逐渐增强,可全面研究两类物质回收率的变化。

称取9份高温处理后的石英砂各10.0 g,分成3组,每组3个平行样品,每个样品分别加入10.0 μL目标物和替代物的中间使用液(1 mg/L),在1.3节的条件下进行处理,最后分别使用3种溶剂组合进行洗脱,洗脱液对回收率的影响见图3。由图3可知,OPPs的回收率随着洗脱液极性的增强而明显升高,其中正己烷-乙酸乙酯(1∶1, v/v)的洗脱效果最好,平均回收率为73.4% ,比正己烷-丙酮(9∶1, v/v)的回收率高27%左右。而对于OCPs而言,正己烷-丙酮(9∶1, v/v)和正己烷-丙酮(1∶1, v/v)的洗脱效果都相对较好,但是极性较强的洗脱液却并不适用,因此,综合考虑两类物质的回收率,本研究选择正己烷-丙酮(1∶1, v/v)作为最终的洗脱液。

图 3 洗脱液对有机氯农药和有机磷农药回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effects of the eluent on the recoveries of the OCPs and OPPs (n=3)

2.2 质谱条件的优化

首先设置质谱分析模式为单质谱扫描,扫描范围为m/z50～450,分别确定13种目标物、2种内标和1种替代物的保留时间及母离子。然后保持程序升温不变,设置质谱分析模式为产物离子扫描,逐步优化每种物质的子离子和碰撞能量,选择响应相对较高的两个子离子,分别设为定量离子和辅助定性离子。最后在MRM模式下,对20.0 μg/L 的混合标准溶液进样分析,得到的色谱图见图4。通过两级质谱对母离子和碎片离子的筛选,所得色谱图背景干净,没有杂峰,且16种物质峰形尖锐对称,分离度较好,可以满足定性与定量要求。

图 4 MRM模式下有机氯农药、有机磷农药、2种内标及1种替代物混合标准溶液(20.0 μg/L)的色谱图Fig. 4 Chromatogram of the OCPs, OPPs, two internal standards and one substitute in a mixed solution (20.0 μg/L) under MRM mode Peak Nos.: 1. DDVP; 2. TCMX; 3. α-BHC; 4. DMT; 5. β-BHC; 6. γ-BHC; 7. PHE-d10; 8. δ-BHC; 9. MPT; 10. MLT; 11. PRT; 12. p,p′-DDE; 13. p,p′-DDD; 14. o,p′-DDT; 15. p,p′-DDT; 16. CHR-d12.

2.3 方法学验证

将1.5节配制的系列标准溶液,根据优化后的参数进样分析,以目标物的质量浓度为横坐标(X, μg/L)、目标物与相应内标的峰面积之比为纵坐标(Y)绘制标准曲线,回归方程和相关系数(R)见表2。由表2可知,13种目标物线性关系良好,R均大于0.995,标准曲线每个点重复测量5次,相对标准偏差为15.6% ～23.8% ,符合质控要求。每日测量时,新配20.0 μg/L 的混合标准溶液进样分析,计算测定值与实际值的相对偏差为10.5% ～22.8% ,说明使用该曲线定量具有较高的可靠性。

在期望的方法检出限(LOQ)范围内选择一个合适的质量浓度(OCPs、OPPs分别为0.50、1.00 μg/L),用精密注射器抽取相应浓度的OCPs标准溶液和OPPs标准溶液各1.0 mL,分别加入到7份10.0 g高温处理后的石英砂中,按照本研究确定的前处理与仪器条件进行分析,计算7次结果的标准偏差(s),则LOQ=s×t(n-1, 0.99),其中,n为样品平行测定次数,t(n-1, 0.99)表示:自由度为n-1,置信度为99%时的t分布(单侧)。通过查表可得,t(6, 0.99)=3.143,由此计算了13种目标物的LOQ,结果见表2。取样量为10.0 g时,OCPs的LOQ为0.02～0.04 μg/kg, OPPs的LOQ为0.06～0.12 μg/kg。

为评价方法的稳定性,称取10.0 g高温处理后的石英砂颗粒,共14份,每份分别加入10.0 μL目标物和替代物的中间使用液(1 mg/L),按照上述优化条件进行萃取、净化和浓缩,并加入内标。选择其中7份日内重复进样,计算方法的日内精密度;选择另外7份连续7日进样,计算方法的日间精密度(见表2)。此外,在高温处理后的石英砂中加入10.0 μL目标物的中间使用液(1 mg/L),依次进行萃取、净化、浓缩及定量检测,分析目标化合物的回收率,结果见表2。

由表2可知,目标物的回收率范围为66.8% ～88.4% ,符合1.6节的质控要求,说明样品的前处理过程并未造成待测物质的明显损失,能够保证定量的准确性。此外,日内与日间精密度均小于10% ,说明方法稳定可靠,可以保证日后的推广应用。

表 2 有机氯农药和有机磷农药的回归方程、相关系数、检出限、回收率、日内精密度和日间精密度(n=7)

Y: peak area ratio of the analyte to internal standard;X: mass concentration of the analyte, μg/L.

图 5 MRM模式下实际土壤样品的色谱图Fig. 5 Chromatogram of a real soil sample under MRM mode Peak Nos. 1. TCMX; 2. α-BHC; 3. DMT; 4. β-BHC; 5. γ-BHC; 6. PHE-d10; 7. δ-BHC; 8. CHR-d12.

2.4 实际样品分析

为验证该方法分析实际样品的可行性,采集连云港市的农用地土壤(n=6)进行检测。图5为按上述步骤进行处理的某一实际样品的色谱图。农用地土壤基质复杂,干扰较多,但通过串联质谱对目标物离子进行两次筛选,所得色谱图基线平稳、背景干净,可以满足定性与定量检测要求。说明该方法对于复杂基质中存在的痕量农药残留具有很强的检测能力,便于及时掌控农用地的OCPs和OPPs污染。

3 结论

本研究采用ASE提取土壤中13种OCPs、OPPs农药,对提取、净化过程中的相关参数进行了优化,建立了GC-MS/MS分析13种物质的方法。一方面,通过优化前处理参数,可对两类物质同时进行处理,选择通用型的质谱检测器进行定性与定量分析,最终实现两类物质的同时测量;另一方面,通过GC-MS/MS两级质谱的筛选,能够在很大程度上扣除背景干扰,大大提高灵敏度,克服单级质谱灵敏度低的不足。该方法样品前处理自动化程度较高,操作简便,检出限较低,回收率、稳定性均能满足质控要求,在提高工作效率的同时,还能够增强土壤中OCPs、OPPs的检测能力,对于例行环境监测及深入科学研究,都具有重要的指导意义。