结直肠腺癌EGFR、CDX2表达的临床病理意义及相互关系*

钱红，王辉，牛国梁，赵娟霞，曹桂明

（南华大学附属南华医院 1.病理科，2.胃肠外科，3.肿瘤科，湖南 衡阳 421002）

结直肠腺癌（colorectal adenocarcinoma, CRC）是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在我国已呈逐年上升趋势，其发生、发展可能是在遗传、环境等多种因素作用下发生的一个多步骤、多阶段的复杂过程，具体机制尚不清楚。研究证明，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和尾型同源框转录因子2（caudal type homeobox genes 2,CDX2）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移以及预后方面发挥重要作用，但在结直肠腺癌中EGFR和CDX2对患者临床病理表现的影响和意义以及它们相互之间的关系研究结论不一。本实验采用免疫组织化学方法检测结直肠腺癌及正常肠黏膜中EGFR和CDX2的表达，并结合临床、病理资料进行分析探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月-2016年10月南华大学附属南华医院病理科结直肠腺癌手术标本170例。所有患者术前均未进行放射或化学治疗。选取30例无癌患者正常肠黏膜作对照，男女比为19∶11，中位年龄51岁，平均年龄59岁。

1.2 方法

所有肿瘤标本均经10%中性甲醛固定12～48 h，常规脱水、石蜡包埋切片，HE和免疫组织化学染色，由两名病理诊断医生双盲作出病理诊断、组织学分类及免疫组织化学染色结果判断，意见不一致的再共同讨论决定。病理诊断及组织学分类按照WHO（2010版）标准。免疫组织化学用SP法染色，试剂盒及抗体购于福州迈新生物技术开发有限公司；EGFR（RMA-0689）、CDX2（EPR2764Y）均为即用型兔抗人单克隆抗体。操作步骤严格按照说明书进行，以已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。

1.3 结果判定标准

显微镜下观察，EGFR阳性染色定位于细胞膜和/或细胞质，CDX2阳性染色定位于细胞核；染色为淡黄色、棕黄色或深棕色为阳性；按照以下标准进行计分：①阳性染色判定标准：未染色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，深棕色3分；②阳性细胞数判定标准：按每400高倍视野阳性细胞占肿瘤细胞的百分比：＞1%0分，1%～24% 1分，25%～50% 2分；＞50% 3分；③以上两项评分乘积为最后得分：＜中位分值为低表达，≥中位分值为高表达。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计数资料用例表示，采用χ2检验和χ2分割法（检验水准经矫正后α=0.008）；EGFR和CDX2的相关性采用Spearman等级相关分析及χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠腺癌的临床病理特征

170例结直肠腺癌患者年龄28～85岁，中位年龄62岁，平均60岁；＜60岁的73例（42.9%），≥60岁的97例（57.1%）；男性112例（65.9%），女性58例（34.1%），男女比1.9∶1；肿块最大径0.8～15 cm，中位4 cm，平均4.3 cm，其中最大径＜4 cm的96例（56.5%），≥4 cm的74例（43.5%）；浸润至黏膜肌层9例（5.3%），浸润肌层33例（19.4%），侵及全层或外膜脂肪组织128（75.3%）例；有淋巴结转移55例（32.4%），神经侵犯30例（17.6%），脉管内癌栓或血管壁侵犯29例（17.1%），系膜或网膜出现癌结节26例（15.3%）；高、中、低分化腺癌分别为44、100、26例，分别占总例数的25.9%、58.8%、15.3%。

2.2 EGFR在结直肠腺癌和正常肠黏膜组织中的表达

结直肠腺癌中EGFR细胞膜和/或细胞质呈不同程度的淡黄色至深褐色着色（见图1）。170例结直肠腺癌EGFR免疫组织化学染色最后综合得分中位数为4分，因此选定＜4分者为低表达，≥4分者为高表达；EGFR高、低表达分别为61例（35.88%）及109例（64.12%），其中高、中、低分化腺癌的EGFR高表达率分别为31.82%、35.00%、46.15%，并且随着腺癌分化程度的降低而逐渐增加。正常肠黏膜中EGFR主要为细胞膜着色；30例对照组中EGFR高表达3例，高表达率为10.00%。不同分化程度结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮EGFR高表达率比较，差异有统计学意义（χ2=9.481，P=0.024），然后进行χ2分割法比较，结果显示，中分化与低分化结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮EGFR高表达率比较差异有统计学意义（P＜0.008），而高分化结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮EGFR高表达率比较无统计学差异（P＞0.008）。但不同分化程度的结直肠腺癌EGFR高表达率两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.3 CDX2在结直肠腺癌和正常肠黏膜上皮中的表达

图1 结直肠腺癌EGFR表达 （SP×400）

表1 不同分化程度的结直肠腺癌及正常肠黏膜EGFR表达

图2 结直肠腺癌CDX2表达 （SP×200）

CDX2在结直肠腺癌及正常肠黏膜上皮中均为细胞核着色，呈不同程度的浅棕黄色至棕褐色颗粒样，近核周的胞质中也有少量颗粒样着色（见图2）。CDX2高、低表达分别为143例（84.12%）及27例（15.88%），其中高、中、低分化腺癌的CDX2高表达率分别为90.92%、87.00%和61.54%。30例正常肠黏膜中CDX2均呈高表达，表达率为100%。不同分化程度的结直肠腺癌组织与正常肠黏膜CDX2高表达率比较，差异有统计学意义（χ2=12.063，P=0.002），然后进行χ2分割法比较，结果显示，低分化结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮CDX2高表达率比较差异有统计学意义（P＜0.008），而高分化与中分化结直肠腺癌的CDX2高表达率与正常肠黏膜上皮CDX2高表达率比较差异均无统计学意义（P＞0.008）。但不同分化程度的结直肠腺癌CDX2高表达率两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同分化程度的结直肠腺癌组织及正常肠黏膜CDX2表达情况

2.4 EGFR和CDX2蛋白表达与结直肠腺癌临床病理表现的关系

170例结直肠腺癌中，EGFR表达与年龄、性别、分化程度、肿块直径、淋巴结转移、系膜或网膜癌结节形成、浸润深度、神经侵犯、脉管癌栓形成均无关，差异无统计学意义（P＞0.05）；但CDX2表达与分化程度、淋巴结转移和脉管内癌栓形成有关（P＜0.05），其中，低分化结直肠腺癌的CDX2高表达率（61.54%）低于高分化及中分化结直肠腺癌的高表达率（90.92%及87.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）；无淋巴结转移者CDX2高表达率（86.96%）高于淋巴结转移者（78.18%），差异有统计学意义（P＜0.05）；无脉管内癌栓形成者CDX2高表达率（86.52%）高于脉管内癌栓形成病例（72.41%），差异有统计学意义（P＜0.05）；但CDX2蛋白表达与年龄、性别、肿块直径、系膜或网膜癌结节的形成、浸润深度、神经侵犯等无关（P＞0.05）。见表 3。

2.5 EGFR与CDX2表达的相关性

EGFR高表达的61例中，CDX2高表达8例，低表达53例，高表达率为13.11%；EGFR低表达的109例中，CDX2高表达90例，低表达19例，高表达率为82.57%。EGFR和CDX2蛋白表达的Spearman相关分析（r=0.057，P=0.463）及χ2检测（χ2=0.545，P=0.518）结果均提示两者无相关性，见表4。

表3 结直肠腺癌EGFR和 CDX2蛋白表达与临床病理参数之间的关系

表4 结直肠腺癌CDX2与EGFR表达的相互关系 例（%）

3 讨论

EGFR是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受体，通过介导多种途径的信号通路调控细胞生长、迁移、黏附、增殖、分化、凋亡和存活，并与肿瘤的形成、侵袭、转移及血管生成、细胞凋亡的抑制和恶性转化密切相关。结直肠腺癌中EGFR表达上调，与预后差、转移快、复发早、生存期短及化疗耐药等相关[1-3]。免疫组织化学检测是目前临床评价EGFR表达的常用方法之一[4]，但报道的EGFR表达率差异较大。为了更准确地反应结直肠腺癌中EGFR蛋白阳性表达的范围和程度，本组采用复合性评分系统[5]，以阳性结果评分与阳性细胞数评分的乘积作为最后得分。本研究显示，随着分化程度的降低，EGFR高表达率逐渐增加，尤其是中分化与低分化结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮EGFR高表达率比较差异有统计学意义，表明EGFR高表达与结直肠腺癌的发生及分化程度关系密切，与文献报道一致[3，6-7]。但EGFR表达与年龄、性别、分化程度、肿块直径、淋巴结转移、系膜或网膜结节的形成、浸润深度、神经侵犯、脉管内癌栓形成均无关，而且高分化结直肠腺癌的EGFR高表达率与正常肠黏膜上皮EGFR高表达率比较差异亦无统计学意义，提示EGFR蛋白表达不适合单独作为转移性结直肠腺癌的预后指标，与部分研究报道不一致[7-8]，这可能与EGFR表达的判定标准不同，或与本组结直肠腺癌大多属临床中晚期有关。此外，有学者提出引起结直肠腺癌细胞增殖和迁移的EGFR的转录机制存在多种信号通路[9-10]，这也提示不能通过单一分子的表达来评判肿瘤的发生、发展。

CDX2是一种特异性的肠道核转录因子，亦是肠道肿瘤发生机制中发挥作用的一个关键因子[11]。有文献报道[12-16]，CDX2是一种抑癌基因，特异性表达于肠上皮性肿瘤中，在引导和维持肠上皮形态和功能方面具有重要作用，能够调节大量肠道特异性基因的表达，与结直肠腺癌的发生发展有着密切关系。本研究结果显示，CDX2对诊断结直肠腺癌具有敏感性，是结直肠腺癌诊断和鉴别诊断的良好指标。本组高、中、低分化结直肠腺癌中，CDX2高表达率均低于正常肠黏膜CDX2表达，表明结直肠腺癌中的CDX2蛋白表达受到抑制；尤其是低分化结直肠腺癌的CDX2高表达率低于高、中分化结直肠腺癌，而且低分化结直肠腺癌的CDX2高表达率与正常肠黏膜上皮CDX2高表达率比较差异有统计学意义，说明CDX2的表达随结直肠腺癌细胞分化程度降低而下调，分化越差，下调越明显，这种现象也提示CDX2具有引导和维持肠上皮形态和功能的作用，支持CDX2是一种抑癌基因的观点。

本研究还发现，29例脉管内癌栓形成的结直肠腺癌患者，其CDX2高表达率低于无脉管内癌栓形成患者，而55例淋巴结转移患者中CDX2高表达率也低于无淋巴结转移患者；说明CDX2蛋白表达与结直肠腺癌发生转移有一定关系；这也反过来证明了CDX2高表达具有抑制结直肠腺癌进展的作用，CDX2蛋白下调可提高结直肠腺癌的恶性程度和转移能力，进一步证实CDX2是一种抑癌基因。有学者[16-18]认为CDX2过表达时能逆转上皮间质转化，从而抑制胃癌、肠癌细胞迁移、侵袭，因此推测结直肠腺癌CDX2表达缺失可能通过促进癌组织发生上皮间质转化而导致侵袭能力的增强及血管和淋巴结转移的发生，但该假设还需要进一步深入研究。

此外，EGFR蛋白高表达的结直肠腺癌中，CDX2蛋白多呈低表达，比例高达86.89%，而EGFR蛋白低表达的结直肠腺癌患者，其CDX2蛋白82.57%呈高表达，似乎提示EGFR与CDX2蛋白表达存在负相关，不过Spearman相关分析及χ2检验均未证实该推测。分析原因，可能与EGFR及CDX2参与肿瘤发生发展的途径存在不同通路有关，但这还有待于大样本数据进行分析和深入研究。总之，探讨多个结直肠腺癌相关基因的表达及其相互关系，才能更全面的了解其发生发展和预后，以期为临床诊疗和筛选高危人群提供重要的参考意义。