姜黄素改善小鼠功能性胃排空障碍的研究*

刘艳婷，于晶，王红伟，于小玲

（青岛大学基础医学院 生理与病理生理学系，山东 青岛 266021）

姜黄素（Curcumin, Cur）是从姜科植物姜黄的根茎中分离出来的一种多酚类物质，作为一种天然的着色剂和调味剂添加在食品中，后期研究发现姜黄素还具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌等多种生物学作用[1-2]。本实验室前期研究发现，姜黄素灌胃对顺铂[3]、外源性一氧化碳NO，以及阿托品[4]造成的小鼠胃肠功能障碍均有显著的改善作用。进一步研究显示姜黄素可通过促进乙酰胆碱（Acetylcholine, Ach）释放而改善顺铂所致的胃排空障碍[3]。姜黄素对单纯功能性胃排空障碍是否也通过Ach途径发挥改善作用需要进一步确认。因Ach释放后迅速被乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AchE）水解成胆碱和乙酸，所以本研究通过检测小鼠胃组织中胆碱的数量变化得到AchE活力，从而反映Ach的释放量。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康昆明种雄性小鼠54只，体重20～22 g，购自山东省鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室。姜黄素（纯度99.9%）、盐酸左旋精氨酸（L-精氨酸）购自美国Sigma-Aldrich公司，阿托品注射液购自天津药业集团新郑股份有限公司，AchE试剂盒购自南京建成生物工程研究所，RNA提取试剂盒购自美国Omega公司，逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自瑞士罗氏生物科技有限公司，AchE、GADPH引物由上海生工生物有限公司设计合成，免疫印记技术测定的试剂购自美国Sigma公司，AchE（Cat.NO.bs-2511R）、β-actin抗体（Cat.NO.bs-0061R）购自中国Bioss公司。姜黄素与5%质量分数的阿拉伯胶溶液配成浓度为25 g/L的混悬液，L-精氨酸使用时与5%质量分数的阿拉伯胶溶液配成浓度为250 g/L的混悬液。阿托品与生理盐水配成0.075 g/L的混合液。

1.2 动物分组与处理

小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组、姜黄素组、L-精氨酸组、阿托品组、姜黄素+L-精氨酸联合组、姜黄素+阿托品联合组，共6组，每组9只。对照组、L-精氨酸组、阿托品组给予溶媒溶液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。姜黄素组、姜黄素+（L-精氨酸）联合组、姜黄素+阿托品联合组给予姜黄素（200 mg/kg）混悬液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。从灌胃的第11天开始，L-精氨酸组、姜黄素+（L-精氨酸）联合组分别给予0.2 ml L-精氨酸（2 g/kg）混悬液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共5 d。阿托品组、姜黄素+阿托品联合组于小鼠测量胃排空前40 min腹腔注射阿托品（0.5 mg/kg）混合液1次。其余组给予等量溶媒溶液灌胃及生理盐水腹腔注射作为对照。

1.3 胃排空率的检测

在末次灌胃结束后，各组小鼠禁食24 h并自由饮水，处死小鼠前20 min时，分别给予0.8 ml 80%质量分数的亚甲蓝混悬液灌胃。脱臼处死小鼠并腹腔解剖，结扎胃贲门部和幽门部，切取胃并称其全质量，然后洗去胃内容物，再次称取胃净质量，计算胃排空率。胃排空率（%）=1-（胃全质量-胃净质量）/0.8 ml亚甲蓝混悬液质量×100%。

1.4 胃组织AchE活力的检测

分别取各组小鼠的新鲜胃组织，用高通量组织匀浆机研磨成10%体积分数的组织匀浆，低温离心后取上清液。严格按照AchE试剂盒说明书进行操作，反应结束后将最终显色的反应液转移到96孔板，使用全自动酶标仪检测在波长412 nm时的吸光度值，然后根据每毫克组织蛋白计算组织匀浆中AchE活力。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应对胃组织AchE mRNA的检测

取冷藏于-80℃冰箱的各组胃组织50 mg，用硅胶柱纯化方式提取胃组织的总RNA，逆转录成cDNA，用LightMix®试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），以GAPDH作为内参。反应条件为 ：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共40个循环。每样本采用3管，计算其平均Ct值。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。AchE正向引物：5'-ACCTGCTTCTCCCACACCT-3'，反向引物：5'-GGTTCCCACTCGGTAGTTCA-3'；内参照GAPDH基因正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.6 Western blot法检测AchE

提取各组小鼠胃组织蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上。将转移好的PVDF膜浸入脱脂奶粉中以阻止后续非特异性结合；PBST洗涤3次后用AchE抗体孵育1 h（37℃）；再用同样方法洗涤、孵育二抗；洗涤之后在PVDF膜上滴加DAB发光染色液，在数码冷光成像分析系统中成像，然后分析条带灰度值，并与相应β-actin的灰度值比较得到相对值。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组数据符合正态分布且方差齐的条件，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对L-精氨酸所致的小鼠胃排空障碍及AchE的影响

与对照组比较，L-精氨酸组小鼠胃排空率降低（t=4.684，P=0.000），AchE mRNA、AchE蛋白表达及AchE活力均下降（t=7.250、6.626和4.933，均P=0.000）；与L-精氨酸组比较，姜黄素+（L-精氨酸）联合组小鼠胃排空率改善（t=3.153，P=0.003），AchE mRNA、AchE蛋白表达及AchE活力均升高（t=4.165、3.718 和 2.936，P=0.000、0.001 和 0.007）；姜黄素 +（L-精氨酸）联合组与对照组比较上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。单用姜黄素组与对照组比较上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和附图。

2.2 姜黄素对阿托品所致的小鼠胃排空障碍及AchE的影响

由表2和附图可见，与对照组比较，阿托品组胃排空率降低（t=6.855，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表达及AchE活力均降低（t=6.559、5.454和4.094，均P=0.000）；与阿托品组比较，姜黄素+阿托品联合组胃排空率改善（t=6.398，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表达及AchE活力均升高（t=3.204、2.978和3.827，P=0.005、0.010和0.003），上述指标虽未完全恢复至正常，但与对照组比较差异已无统计学意义（P＞0.05）。单用姜黄素组与对照组比较上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 姜黄素对L-精氨酸所致的小鼠胃排空及 AchE 的影响 （n =9，±s）

AchE活力/（u/mg）对照组 68.94±10.96 1.00±0.20 0.78±0.13姜黄素组 62.00±13.84 0.89±0.20 0.70±0.16 L-精氨酸组 41.43±13.78 0.47±0.09 0.50±0.11姜黄素+（L-精氨酸）联合组 60.32±11.54 0.80±0.22 0.69±0.19组别 胃排空率/% AchE mRNA表达F值 8.440 18.348 6.395 P值 0.000 0.000 0.002

表2 姜黄素对阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影响 （n =9，±s）

表2 姜黄素对阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影响 （n =9，±s）

AchE 活力/（u/mg）对照组 68.94±10.96 1.00±0.15 0.77±0.14姜黄素组 62.00±13.84 0.93±0.20 0.74±0.18阿托品 37.77±8.12 0.58±0.12 0.49±0.15姜黄素+阿托品联合组 63.75±9.08 0.82±0.19 0.72±0.10 F值 14.539 18.348 7.241 P值 0.000 0.000 0.001组别 胃排空率/%AchE mRNA表达

附图 各组小鼠胃组织中AchE蛋白表达

3 讨论

L-精氨酸和阿托品均可造成功能性胃肠蠕动障碍。其中L-精氨酸是NO前体，在体内被一氧化氮合酶（nitricoxide synthase, NOS）催化生成NO，NO由鸟苷酸环化酶激活经环磷酸鸟苷[5]，作用于化学门控的钙释放通道，引起细胞内Ca2+库释放的Ca2+减少，从而松弛胃肠道平滑肌，抑制胃肠道蠕动。也有研究认为NO可直接抑制Ach的释放而起松弛平滑肌的作用[6]。阿托品作为M胆碱受体阻断剂能够阻断Ach与相应受体结合，从而使胃肠平滑肌松弛，降低胃肠蠕动的频率和幅度，从而使胃肠蠕动障碍。两者造成胃肠蠕动障碍均与Ach有关，Ach作为胃肠的兴奋性神经递质，由神经末梢释放后，与M胆碱能受体结合，激活G蛋白[7]与磷脂酶C结合分解生成第二信使，从而参加一系列级联反应，引起细胞内Ca2+增加，引起平滑肌收缩[8]。与胆碱受体结合后和未与胆碱受体结合的Ach迅速被AchE水解成胆碱和乙酸被回收到神经末梢作为生成Ach的原料。本研究中采用的试剂盒就是通过检测胆碱的数量得到AchE的活力，从而反映Ach的释放量。结果显示，在L-精氨酸和阿托品造成功能性胃排空障碍时，胃组织中AchE活力降低并且mRNA和蛋白的表达量下降，说明外源性NO和阿托品引起的胃排空障碍均与Ach释放减少有关。给予姜黄素灌胃后可以显著改善NO和阿托品所致的胃排空障碍，并且AchE的活力和mRNA以及蛋白表达均得到改善，说明姜黄素可能通过促使Ach释放改善胃排空。

姜黄素在体内如何增加胃组织Ach释放目前尚不清楚。本实验室以往研究显示在顺铂造成的胃肠损伤中，姜黄素可抑制小鼠胃组织NOS的活性从而减少NO的产生[9]，姜黄素抑制NO产生的作用在其他研究中同样得到验证[10-11]。如前所述，NO可以抑制Ach而松弛平滑肌[6，12]，因而推测在L-精氨酸模型中，姜黄素可能是通过抑制胃组织NO产生进而增加Ach释放，从而改善胃排空，这可能是姜黄素发挥作用的机制之一。在阿托品模型中，姜黄素预先灌胃使Ach释放量增加的具体机制尚不清楚，但是姜黄素对多种疾病模型中Ach以及AchE的研究有类似报道。服用姜黄素的大鼠可提高机体中谷胱甘肽水平及AchE活性，可以减轻秋水仙素引起的大鼠因脂质过氧化而产生的认知功能障碍[13]。姜黄素可使镉中毒小鼠脑内AchE的活力显著提高并且呈现剂量依赖性[14]。姜黄素还促进大鼠脑组织Ach释放，这是改善因β-淀粉样蛋白诱导的炎症反应所致的阿尔茨海默病的机制之一[15]。

综上所述，在外源性NO和阿托品造成的两种功能性胃排空障碍的模型中，姜黄素均可通过影响Ach的释放而改善小鼠的胃排空，这也为将来姜黄素对胃肠功能的研究提供思路。姜黄素的药理作用广而毒副作用小，近期又制备出了提高姜黄素溶解性的复合材料[16]，相信未来一定有广阔的前景。