稻草秸秆降解菌的筛选及其初步鉴定

唐彦文，黄嘉兴，杜亚彬，李想，王美枝，刘晓丹

摘要：本研究选取吉林市近郊稻草堆肥及长白山原始森林土样，以稻草秸秆粉为唯一碳源进行富集培养，利用愈创木酚为底物进行初筛，最终筛选得到了1株降解特性较强菌株JNKJ5；进一步经过形态学观察和ITS序列分析，该菌株初步鉴定为糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）。

关键词：纤维素降解菌；篩选；菌株鉴定

基金项目：吉林省高等学校大学生创新项目；吉林农业科技学院博士启动基金；吉林农业科技学院青年基金

中图分类号： S816 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.020

我国是世界上最大的稻米生产国家，占全世界产量的35%，每年产生水稻秸秆约1.9×109t[1]。目前大量的水稻秸秆采用焚烧处理，这样处理造成的危害极大，秋季雾霾的形成往往与焚烧秸秆有直接关系。稻草秸秆中丰富的纤维素、半纤维素和木质素等组分使得水稻秸秆的自然降解率低[2]。目前，处理秸秆最实际且有效和经济的方法是微生物降解法[3]。而选择具有高效降解特性的微生物菌株，是目前处理秸秆的关键问题。

经过初筛获得了高效降解菌株，在此基础上，采用形态学观察和ITS序列分析相结合的方法对菌株可进行鉴定。希望能为构建工厂化稻草秸秆高效降解的工程菌株提供菌源和本研究以稻草秸秆为唯一碳源富集培养，进一步以含0.1%愈创木酚的PDA培养基进行筛选，保证了筛选的高效性。技术支撑，对于促进我国秸秆生物质资源的充分利用、环境保护和农业可持续发展贡献力量。

1 试验方法

1.1稻草秸秆降解菌的筛选

采用以稻草秸秆粉为唯一碳源的固体培养基进行富集培养[4]。按1∶10（质量比）的接种量称取两种土样，接种于富集培养基中，混匀，封口后，28℃恒温培养15d，然后将其转接在新鲜的培养基上，连续转接3次后进行菌种分离。每个土样做三个重复。

采用平板稀释法对菌株进行纯化，将纯化的菌株编号保藏。

将保藏的菌株活化后，使用打孔器获得生长状态一致菌块，接种于0.1%愈创木酚的PDA培养基中[5]，28℃恒温培养，定期观察有色圈的形成情况。

1.2 稻草秸秆降解菌的鉴定

菌株的鉴定采用形态学观察和ITS序列分析相结合的方法[6]。

2 结果与分析

2.1 稻草秸秆降解菌的筛选

在富集培养的基础上，利用愈创木酚为底物筛选降解秸秆的菌株。最终共筛选到6株活性较强的菌株，命名为JNKJ1-6。其中，菌株JNKJ5产酶较早，接种24h后产生明显红棕色的有色圈，且最终形成的有色圈直径大、颜色最深（见图1）。

2.2 稻草秸秆降解菌株的鉴定

2.2.1 形态学特征观察 将筛选纯化的菌株接种在PDA平板培养基上，培养温度为28℃，定期观察菌株的生长情况。菌株JNKJ5生长较快，3d可以大致覆盖平板；菌落颜色由起初的白色变为最终的浅灰色；菌落中间致密外周大较疏松，呈放射状，与培养基结合紧密，菌丝茸毛装，形似蜘蛛网，如图2所示，初步判断可能为白腐菌。

2.2.2 ITS序列分析 对已筛选出的纤维素降解菌株进行rDNA ITS 序列扩增，进一步构建系统发育树对其进行分子生物学鉴定。

ITS 序列的PCR扩增选用引物ITS1和ITS4[6]，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3，扩增获得一条特异条带，长度在500～750bp。将PCR产物送至测序公司进行测序（见图3）。

将测序结果在NCBI进行BLAST，通过相似性信息对比，可初步断定菌株JNKJ5属于Pleurotusostreatus，选择与该菌株同属不同种的几种菌构建系统发育树。结果表明，该菌株与Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii在同一个分支上，亲缘关系最近，属于糙皮侧耳。

3 结论

以稻草秸秆为唯一碳源，以吉林市近郊、原始森林腐殖土样为样本，利用愈创木酚-PDA培养基筛选获得1株活性较高的菌株，命名为JNKJ5。通过菌落形态特征观察和ITS序列分析初步鉴定分别为糙皮侧耳。

参考文献

[1]中华人民共和国国家统计局.2009年中国国家统计年鉴[M].北京：中国统计出版社，2009.

[2]宋安东，张百良.杂色云芝产木质纤维素酶及对稻草秸秆的降解过程[J].工程学报，2005（04）：414-419.

[3]蔡艳玲.水稻秸秆降解研究进展[J].广东农业科学，2014（02）：120-124，132.

[4]辛亚平，昝林森，杜双田.降解纤维素菌株筛选及其鉴定[J].畜牧兽医杂志，2011（05）：1-5.

[5]王宜磊，朱陶，邓振旭.愈创木酚法快速筛选漆酶产生菌[J].生物技术，2007，17（02）：40-42.

[6]高山，胡平，边银丙，张金霞.基于ITS序列对3个侧耳菌种的分子鉴定[J]. 湖北农业科学，2008，47（12）：1390-1393.

作者简介：唐彦文，在读本科生，研究方向：生物技术。

通讯作者：刘晓丹，博士，讲师，研究方向：酶与蛋白质工程的研究。