包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构

王维奇,王秀杰,李 军,王思宇



包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构

王维奇,王秀杰,李 军*,王思宇

(北京工业大学建筑工程学院,北京 100124)

采用聚乙二醇二丙烯酸酯作为载体,分别以N,N,N,′N′-四甲基乙二胺(TEMED),过硫酸钾(KPS)作为促进剂和引发剂,对厌氧氨氧化菌进行包埋固定化.采用正交试验优化包埋条件,得到的最佳条件为: 10% PEGDA单体,0.25% KPS,0.5% TEMED,最佳的操作条件为:聚合温度20℃,聚合时间控制在5min左右,菌胶比选取1:1.包埋颗粒的连续流实验表明,颗粒经过短暂的活性恢复后,脱氮效果不断提升,并且对水力负荷的提高有一定的抗冲击能力.扫描电镜(SEM)表明本实验包埋材料具有很好的生物相容性,且具有良好的传质性能.高通量测序显示,稳定运行一段时间后,颗粒内微生物多样性略有减小,厌氧氨氧化功能菌占整个微生物体系比例由6.58%上升至9.8%,微生物种群的变化说明了包埋后厌氧氨氧化性能能够得到更大的提升.

厌氧氨氧化菌；聚乙二醇二丙烯酸酯；包埋；脱氮；微生物群落结构

厌氧氨氧化(ANAMMOX)是指在厌氧或缺氧条件下,一类浮霉菌门细菌以亚硝酸盐为电子受体,将铵盐氧化产生氮气并产生少量硝酸盐的过程[1-3].与传统生物脱氮工艺相比,厌氧氨氧化工艺具有能耗低,占地面积小,产生的剩余污泥量少,不需要外加有机碳源等优点[4].但无论是絮状还是颗粒厌氧氨氧化污泥,都存在菌体流失,颗粒形成过程缓慢的问题[5-6];因此减少或者防止厌氧氨氧化菌体流失,保持生物量成为研究厌氧氨氧化工艺的主要方向之一[7-8].20世纪70年代中期,水处理领域引入了微生物固定化技术,目前该技术已进入实用开发阶段.微生物固定化技术是经过特定的技术方法将细菌细胞固定在一定的载体上,能够减少甚至防止发生菌体流失现象,并提高细菌的可利用率,从而达到简化处理工艺,提高应用效率的目的[9].

包埋法固定微生物是目前普遍应用的一种固定化方法[10-11],其采用特定的材料将微生物菌株包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内,以达到提高生物量的目的.然而现有包埋材料制备的厌氧氨氧化包埋颗粒普遍存在生物活性低,机械强度不足,长期运行稳定性不够等一系列问题,即使通过各种方式对包埋颗粒进行强化,效果也并不明显[12-13].另外,由于厌氧氨氧化菌的世代周期长,细胞产率低,且易受环境条件影响等特点[14],使得厌氧氨氧化菌的包埋成为难点.聚乙二醇二丙烯酸酯作为一种新型包埋材料,多用于硝化菌以及反硝化菌的固定化研究, 例如将其用于包埋硝化细菌,并与弹性塑料填料硝化生物膜反应器作对比,启动30d后,包埋反应器硝化速率达到39mgN/(L·h),优于生物膜25mgN/(L·h)[15];此外,将其作为反硝化菌的载体,用于处理硝酸盐合成废水,16d后,发现反硝化速率高达4.4kgN/ (m3·d)[16].然而其用于包埋厌氧氨氧化菌的研究却鲜有报道.因此本实验采用其作为固定化介质[17],对厌氧氨氧化菌进行固定化试验.为制备具有良好机械性能和脱氮效果的包埋颗粒,本实验设计了正交试验对包埋条件进行了优化.并观察了包埋颗粒长期运行的稳定性,分析了运行前后微生物群落的变化,以探索本包埋材料的特点以及应用的优势.

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

厌氧氨氧化污泥取自实验室稳定运行4a的UASB反应器[18];实验所用药剂及仪器:聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA),生化试剂;四甲基乙二胺(TEMED),生化试剂;过硫酸钾(KPS),分析纯;磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),分析纯;磷酸氢二纳(Na2HPO4.12H2O),分析纯;氯化钠(NaCl),分析纯;氯化钾(KCl),分析纯.

实验用水采用人工配水,主要成分见表1,微量元素Ⅰ和Ⅱ参照文献[19],pH值为7.5~8.0.

表1 人工模拟废水成分组成

微量元素Ⅰ组成:FeSO4, 5g/L;EDTA, 5g/L;微量元素Ⅱ组成:EDTA, 15g/L; CuSO4·5H2O, 0.2g/L; ZnSO4·7H2O, 0.43g/L; CoCl2·6H2O, 0.24g/L; MnCl2·4H2O, 0.99g/L; NaMoO4·2H2O, 0.22g/L; NiCl2·6H2O, 0.19g/L; NaSeO4, 0.11g/L; H3BO3, 0.014g/L; NH4+-N, NO2－-N分别用NH4Cl和NaNO2按需配制.

1.2 固定化颗粒的制备

1.2.1 污泥浓缩液的制备 由UASB反应器取得的厌氧氨氧化颗粒污泥,将其打碎,经PBS (0.1mol/L, pH 7.4)冲洗2~3次,除去污泥表面的残留基质, 4000r/min离心10min,制得污泥浓缩液.

1.2.2 包埋颗粒制作过程 取一定量PEGDA溶解于磷酸缓冲溶液中,加入一定量的TEMED并将pH调至7.0,将制得的溶液与污泥浓缩液按一定比例混合,搅拌均匀.加入一定量KPS,迅速搅拌,一定温度下(20~30℃)聚合一定时间后混合液成固态,将形成的凝胶切成3mm×3mm×3mm的立方体,即得PEGDA包埋颗粒.将制得的包埋颗粒用去离子水冲洗彻底,将未交联的PEGDA单体和未固定的厌氧氨氧化菌洗出.而后浸泡于去离子水中,低温避光贮存.

1.3 分析方法

1.3.1 水质分析方法 NH4+-N:纳氏试剂光度法;NO2－-N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3－-N:麝香草酚分光光度法;pH/温度:WTW/Multi3420测定仪.

1.3.2 包埋颗粒机械稳定性测定方法 取大小相似的包埋颗粒各30粒加入血清瓶反应器(图1)中,加入400mL去离子水,600r/min磁力搅拌48h后观察完好包埋颗粒占原颗粒数的比例[20].

1.3.3 厌氧氨氧化性能的测定方法 包埋颗粒厌氧氨氧化性能测定装置如图1所示.取活化后的包埋颗粒40mL,转入500mL的带塞血清瓶中,血清瓶用黑色反光纸包裹,加入400mL人工废水,放在恒温磁力搅拌器上.进气口通过通高纯氮气30min左右以吹脱水中的溶解氧进而保证厌氧环境.磁力搅拌器转速150r/min,温度保持30℃.隔一定时间用注射器通过进气口取样.每个实验设置3组平行取平均值.

1.3.4 扫描电镜分析 包埋颗粒扫描电镜(SEM)分析:取出包埋颗粒,清洗后经2.5%戊二醇固定1.5h,PBS清洗3遍,随后经体积分数为50%,70%, 80%,90%,100%乙醇梯度脱水,每次10~15min,最后用乙酸异戊酯置换,冷冻干燥24h后在样品表面镀上一层1500nm厚的金属膜,采用Hitachi S-4300型扫描电镜进行观察.

图1 厌氧氨氧化性能测定装置

1.3.5 连续流稳定运行及微生物群落结构分析

(1)连续流运行:为了进一步研究包埋颗粒脱氮效果,采用连续流运行的方法,运行装置为有效容积约6L的UASB反应器,外部覆盖一层遮光保温层.水浴控制运行温度稳定在32℃左右.包埋颗粒通过琉璃球与鞭式填料按照体积填充率10%投加均匀分布于反应器中.实验采用人工配水,其中NH4+-N质量浓度约为35mg/L,NO2--N质量浓度约为45mg/L,其余按照表1配制.

(2)微生物群落结构分析:为研究包埋材料对厌氧氨氧化菌的影响以及运行稳定后颗粒内部微生物的结构,取少量刚包埋后以及60d后稳定运行的包埋颗粒,利用Miseq高通量测序对比分析包埋颗粒的微生物群落以及多样性的变化.

使用Usearch软件(版本8.1.1831)对样品的有效序列进行OTU聚类,聚类标准为97%相似.基于前述OTU聚类结果,调用Mothur软件(版本1.30.1),计算各个样品shannon、Simpson、Coverage指数值并绘制相关曲线图,参数为默认参数.采用RDPclassifier软件(版本2.12)将前述各样品合格序列进行物种分类操作,阈值设置为0.8,低于该阈值的分类结果被划归为unclassified一类.分类完成后采用自写perl脚本统计各物种门、属比例并用自写R脚本绘制相关柱状图.采用STAMP软件(版本2.1.3),采用默认参数,基于物种分类结果得到的在不同水平上各rank的丰度值,比较样本或组间丰度差异,找出样本或组间丰度存在显著差异的物种分类,筛选条件为£0.05.

2 结果与分析

2.1 正交法优化包埋条件

实验将单体浓度、催化剂浓度、引发剂浓度、聚合温度、菌胶比作为正交因素应用到实验设计中.固定单体浓度、催化剂浓度、引发剂浓度作为正交实验的3因素,分别以聚合温度,菌胶比作为第4个因素,进行2次正交实验,分别考察其对固定化颗粒相对活性,机械稳定性的影响. 凝胶时间与反应温度密切相关,当单体、引发剂和催化剂浓度一定时,反应温度越高,凝胶时间越短.由单因素实验可知聚合温度在15℃以下时,聚合反应很难进行,聚合温度在20~30℃之间时,凝胶时间下降非常明显,20℃时大分子单体的凝胶时间可以下降到5min左右(具体数据未列出);但如果聚合反应温度过高,反应速率将过快,使得交联度分布不均匀,形成的水凝胶外观浑浊不透明,硬度也不均一.针对本研究中的应用于微生物固定化的PEGDA凝胶,为了控制聚合反应以适当速率进行,以及考虑到过高温度对微生物的灭活作用,因此控制聚合温度为20℃~30℃.设置单体浓度范围8%~12%,催化剂浓度范围0.25%~1%,引发剂浓度范围0.25%~1%,菌胶比范围0.5~2.凝胶时间统一为5min.具体因素水平设置如表2所示.

表2 因素水平1

由表3可知,以包埋颗粒活性为参考值,4个因素的最优水平是A1B1C1D1,即PEGDA单体浓度8%,催化剂浓度0.25%,引发剂浓度0.25%,温度控制在20°C.4种影响因素的主次为D>A>B>C.可见,试剂用量越少,温度越低,得到的包埋颗粒的活性越高.其中,温度对于包埋菌体的活性具有较大的影响,过高的聚合温度可致使菌体活性完全丧失.单体浓度和催化剂浓度对菌体活性的影响程度大小相接近,而催化剂的用量相对于单体的用量非常的少,这也正侧面的说明了TEMED对生物的毒性.在满足要求的情况下需要最大程度的降低催化剂的浓度,防止其对包埋菌的活性造成不可逆转的影响.

表3 正交实验结果1

表4 因素水平2

表5 正交实验结果2

由表5可知,以包埋颗粒机械稳定性为参考值,实验设置的4个因素的最优水平是A2B3C1E2,即PEGDA单体浓度10%,催化剂浓度1%,引发剂浓度0.25%,菌胶比为1:1.4种影响因素的主次为A>E>C>B.综合考虑表3,表5得到包埋颗粒的活性以及机械稳定性,催化剂用量0.5%已能够满足包埋颗粒的稳定性要求,降低催化剂的用量可极大提高包埋颗粒活性.所以,综合考虑,选取PEGDA单体浓度10%,催化剂浓度0.5%,引发剂浓度0.25%,菌胶比为1:1,温度控制为20℃.

2.2 连续流运行及扫描电镜分析

为了进一步研究包埋颗粒的长期运行脱氮性能,进行了为期100d的连续流运行实验.从图2可以看出,前期的包埋处理对厌氧氨氧化菌的活性产生了一定的影响,因此前10d为包埋颗粒活性的恢复阶段,10~100d为包埋颗粒的稳定运行以及性能逐渐提升阶段.包埋颗粒经过活性恢复后NH4+-N的去除率从一开始的24%提高到48%,NO2－-N的去除率从22%提高到43%.随着包埋颗粒脱氮效果的不断提升,第40d时,NH4+-N和NO2－-N的去除率分别达到91%和83%,第41d将水力停留时间从之前的12h缩短为8h,由图中可以看出,虽然出水氮浓度有所提高,但是NH4+-N和NO2--N的去除率依然能有63%和55%,这一现象说明包埋颗粒有一定抗负荷冲击能力,当氮负荷突然升高,本包埋材料会削弱氮负荷的升高对厌氧氨氧化污泥的冲击影响,本实验的41~46d表现一段平稳的去除效果,之后包埋颗粒逐渐适应氮负荷的变化,活性开始继续升高,这一现象与Bae等[21]的研究结果类似.实验期间,出水未检测到污泥的流出,也并未观察到包埋颗粒的破碎,种种现象表明,本包埋颗粒具有良好的污泥截留效果以及良好的稳定性.

运行60d时,取少许包埋颗粒观察其外观形态及扫描电镜(SEM)分析,如图4所示.图4(c)为运行60d后的数码照片,与刚包埋的相比(图3(a)),不难看出,厌氧氨氧化菌在颗粒内部大量增长,这也从侧面显示了厌氧氨氧化效果不断的提高.观察包埋颗粒,可以看出,颗粒依然保持着小正方体的形态,并未出现破碎,缺损的现象,表明本实验所用包埋材料能够用于长时间运行.图4(a)和图4(b)分别为放大5000倍包埋材料形成的内部孔道以及放大10000倍切开包埋材料后内部生长的厌氧氨氧化细菌,可以看出,本包埋材料不仅稳定性好,而且具有良好的传质性能,能够为细菌提供良好的生长环境,从而使得脱氮效果不断提升.

图2 反应器进出水NH4 +-N, NO2--N, NO3--N

图3 包埋后颗粒数码照片

图4 运行60d后包埋颗粒内部扫描电镜及外观数码照片 Fig.4 Internal scanning electron microscopy and appearance digital photos of embedded particles after 60 days of operation

表6 生物多样性分析

2.3 微生物群落结构分析

取少量刚包埋后以及运行60d后的颗粒,利用Miseq高通量测序对比分析颗粒中微生物群落和多样性的变化.其中Shannon指数值和Simpson指数值指示样本微生物群落的多样性.Shannon值越大,Simpson指数值越小,说明群落多样性越大.

检测结果如表6所示,Coverage值指样本的文库覆盖率,两样品的Coverage值分别为0.96和0.95,说明本次测序的真实性比较高.运行60d后,Shannon指数有所下降,Simpson指数也相应的少量增加,两者的变化都表明包埋颗粒经过一段时间的运行,内部微生物群落的多样性有所降低.本实验测得的两Shannon 指数均低于Du等[22]研究的厌氧氨氧化UASB反应器的Shannon指数4.94,原因可能是本实验采用的完全是人工配水,而Du等的研究引入了真实的生活污水.

图5 门水平物种相对丰度分布

图6 属水平物种相对丰度分布

由图5可知,运行前后,颗粒内部微生物群落所测得相对丰度³1%的门都隶属于7个门,分别为变形菌门Proteobacteria,浮霉菌门Planctomycetes,拟杆菌门Bacteroidetes,绿弯菌门Chloroflexi,酸酐菌门Acidobacteria,Ignavibacteriae,厚壁菌门Firmicutes.但是运行前后这几个门所占比例均有较大变化,变形菌门由70.79%降到48.78%,虽然降低幅度很大,但占整个微生物体系比例依然最大,这与多数厌氧氨氧化反应器细菌群落分布情况相一致[23].其次是浮霉菌门,运行前后所占比例都仅次于变形菌门居于第二,由7.46%增长到15.9%,增长了2倍多.反应器中的功能菌为厌氧氨氧化菌,属于浮霉菌门,这一结果充分说明了本实验所用包埋材料适用于厌氧氨氧化菌的生长,能够促进厌氧氨氧化菌的富集.李滨等分析了稳定运行的UASB厌氧氨氧化反应器,发现浮霉菌门仅占3.1%[24],本实验测得的浮霉菌门比例均高于李滨等[24]的研究,分析可能是本实验的接种污泥为实验室稳定运行几年的厌氧氨氧化污泥的原因.拟杆菌门,酸酐菌门比例均有所下降,分别由5.48%,5.25%下降到5.25%,3.48%;厚壁菌门,,绿弯菌门比例均有所增长,分别由2.91%,3.61%,2.53%增长到11.31%,4.86%,6.08%.

从属层面看,如图6,变形菌门主要包含19个属,刚运行时最多的为,占9.67%,运行60d后测得占最大比例,为5.90%,所占比例下降为4.72%.本实验的功能菌为厌氧氨氧化菌,2种厌氧氨氧化菌(和)都有被检测出来,这2种属广泛存在于淡水系统和生物反应器中.其中,比例较低,占据主要部分,与Cao等[23]研究有所差距,Cao的研究为占据主要部分.运行60d后,相对增长,但并不明显,而所占比例由6.58%增加到9.8%,增长较为显著,由原来属水平的第3位上升为第一位.这一结果有力地说明了,相对颗粒污泥,包埋后的厌氧氨氧化颗粒能够进一步扩大厌氧氨氧化功能菌所占比例,从而进一步提高脱氮效果.这也相应地为连续流运行时水力负荷突然提高,本实验所用包埋颗粒能够具有良好的抗冲击能力给出了合理的解释.

3 结论

3.1 综合考虑包埋颗粒的活性和机械稳定性能,聚合凝胶最优配比为:10%PEGDA单体,0.25%KPS, 0.5%TEMED.为保证厌氧氨氧化菌包埋后的性能,最佳的操作条件为聚合温度控制在20℃左右,聚合时间控制在5min左右,菌胶比选取1:1.

3.2 100d的连续流运行效果观察显示,前10d是颗粒的活性快速恢复阶段,10d后反应器运行效果趋于稳定,脱氮性能逐步提高,NH4+-N和NO2－-N的去除率分别达到91%和83%.在41d,将水力停留时间从12h降为8h,NH4+-N和NO2－-N的去除率仍然能达到63%和55%,包埋颗粒表现出一定的抗水力负荷冲击能力.

3.3 观察运行60d后扫描电镜(SEM)和颗粒外观形态,能够看出:本实验所采用的包埋材料具有良好的传质性能,能够为微生物提供良好的生长环境,且具备良好的生物截留能力.表明本包埋材料能够应用于长期运行.

3.3 包埋颗粒微生物分析显示,运行60d后,颗粒内部微生物的多样性有所降低.由门水平物种相对丰度可知,变形菌门比例下降幅度巨大,由70.79%降为48.78%;浮霉菌门比例大幅度提高,增长了两倍多,由7.46%增长到15.9%.由属水平物种相对丰度可知,颗粒内部的厌氧氨氧化菌主要为,占整个微生物群落的比例由6.58%增加到9.8%,增长显著,由开始属水平的第3位上升为第1位.表明本实验的包埋材料具有良好的生物相容性,能够进一步扩大厌氧氨氧化功能菌所占比例,从而进一步提高脱氮效果.

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Nitrogen removal characteristics and microbial community structure analysis of entrapped anaerobic ammonium oxidizing bacteria.

WANG Wei-qi, WANG Xiu-jie, LI Jun*, WANG Si-yu

(The College of Architecture and Civil Engineering, Bejing University of Technology, Beijing 100124, China)., 2018,38(9)：3343~3350

Using polyethylene glycol diacrylate as carrier materials, respectively with N, N, N, ′N′-tetramethylethylenediamine (TEMED) as promoter and potassium persulfate (KPS) as initiator to immobilize anaerobic ammonium oxidizing bacteria. Orthogonal experiments were used to optimize immobilization conditions of anaerobic ammonium oxidation bacteria: 10% PEGDA monomer, 0.25% KPS, 0.5% TEMED, the optimum operation condition was to control the polymerization temperature at 20℃, polymerization time was about 5min, The ratio of bacteria to gum was 1:1. The continuous flow experiment of immobilized pellets showed that after a short period of activity recovery, the nitrogen removal effect was continuously improved,and it had a certain impact resistance to the increase of hydraulic load. The scanning electron microscopy (SEM) showed that the immobilization materials have good biocompatibility and good mass transfer performance. High-throughput sequencing showed that after a period of time of stable operation, the microbial diversity in the pellets decreased slightly. And thethat belongs to anaerobic ammonium oxidizing bacteria which accounted for 6.58% of the total microbial system was up to 9.8%, the changes in microbial population showed that the performance of anaerobic ammonium oxidation could be improved greatly after immobilization.

anaerobic ammonium oxidizing bacteria；polyethylene glycol diacrylate；immobilization；nitrogen removal；microbial community structure

X703.5

A

1000-6923(2018)09-3343-08

王维奇(1993-),男,江苏盐城人,北京工业大学硕士研究生,主要从事污水处理与资源化方面的研究.

2018-03-05

水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX07202-013);北京市基金面上项目(8172012)

* 责任作者, 教授, 18811715723@163.com