原料及加工工艺对包馅鱼肉卷N-亚硝胺含量的影响

王 洋，熊凤娇，李秀明，周 伟，吴晨燕，马俪珍,,*

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.天津农学院食品与生物工程学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，天津 300384）

N-亚硝胺广泛存在于熏制、油炸[1]、腌制[2-3]等各类水产制品[4]中，其是由胺类与氮氧化物反应生成的毒性化合物，对人体健康极为有害，尤其是挥发性N-亚硝胺具有致癌性[5]。鱼糜制品是以冷冻鱼浆为主要原料，添加辅料斩拌，成型后经水煮、油炸等热处理而制成的风味水产品。熊凤娇等[6]调查发现，鱼豆腐、风味烤鱼卷等各类鱼糜制品中均含有挥发性N-亚硝胺。

食品中N-亚硝胺的含量可能受到多种因素影响，亚硝酸盐是N-亚硝胺的底物，其含量越高，产品中N-亚硝胺含量也越高[7-8]。脂肪的比例及种类会影响N-亚硝胺的含量[9]，脂肪氧化产生的醛、酸、酮等小分子物质对N-亚硝胺的形成有促进作用[10-11]。另外，加工条件会影响N-亚硝胺的合成，如高温可促进N-亚硝胺的合成[7]，因此经高温烹调的油炸鱼、烟熏鱼中普遍含有挥发性N-亚硝胺[1,12]。然而，目前鱼糜制品中N-亚硝胺的形成规律和影响因素并未见报道。

包馅鱼肉卷是一种消费量较大的鱼糜制品，本研究探究包馅鱼肉卷加工过程中皮和馅的N-亚硝胺含量及相关理化指标（硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reaction substances，TBARs）值、亚硝酸盐和挥发性盐基氮（total volatile nitrogen，TVB-N）含量）的动态变化，确定影响包馅鱼肉卷中N-亚硝胺含量的主要因素，为工业生产中控制鱼糜制品中N-亚硝胺的含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

包馅鱼肉卷皮和馅料原料及加工过程中的样品，取自国内某鱼糜加工厂。

N-亚硝胺的混合标准品（均为色谱纯）：N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-甲基乙基亚硝胺（N-nitrosoethylmethylamine，NMEA）、N-二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亚硝胺（N-nitrosodinpropylamine，NDPA）、N-二丁基亚硝胺（N-nitrosodi-n-butylamine，NDBA）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）和N-亚硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPheA） 美国Sigma公司；氯化钠、硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硫代巴比妥酸（thiobarbital acid，TBA）、三氯乙酸、氯仿、氧化镁混悬液、硼酸吸收液、盐酸、甲基红及次甲基蓝混合指示剂（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

安捷伦7890A气相色谱仪 美国安捷伦公司；固微相萃取（solid-phase microextraction，SPME）装置、PDMS/DVB/CAR萃取头 美国Supelco公司；TU-1800紫外分光光度计 日本Hmadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 包馅鱼肉卷加工工艺

包馅鱼肉卷馅：主要原料为鸡小胸、油葱、鸡皮、SH-52、玉米淀粉及6号胶。首先在斩拌机中放入鸡小胸进行斩拌至糊状；然后加入大蒜瓣、复合磷酸盐、肉精膏进行斩拌；斩拌至糊状之后加入食盐、白砂糖、葡萄糖、I＋G、香料粉等小料以及6号胶、玉米淀粉、SH-52、鸡皮、色素等，继续斩拌（盐擂）。

包馅鱼肉卷皮：主要原料为带鱼浆、6号胶、SH-52、乳化浆、乳化鸡皮、增味剂、I＋G、虾肉卷诱惑红及虾肉卷红曲红。在斩拌机中放入带鱼浆慢速斩至糊状；加入保水剂（复合磷酸盐）、乳化浆；加入大蒜瓣，继续斩拌至细腻无颗粒，加入海鲜味液态香精慢速斩拌；加入食盐、白砂糖、葡萄糖、I＋G等小料斩拌（盐擂）均匀；加入乳化鸡皮快速斩拌；加入6号胶斩拌；最后加入SH-52，斩拌均匀。

皮料与馅料混合成型后，于水中煮制，至漂浮于水面后迅速冷却。本研究在不同时间点先后从工厂采购2 批样品，每个样品各项指标均至少平行测定3 次。采集皮和馅的原料、关键工艺点半成品及成品，每个取样点取样约200 g，取完立即放入装有冰袋的泡沫箱中运回实验室，并于－20 ℃冷冻贮藏，14 d内完成各项指标的测定。

1.3.2 理化指标测定

TBARs值：参考Faustman等[13]的方法；TVB-N含量：参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[14]中的半微量定氮法；亚硝酸盐含量：参照GB/T 5009.33—2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[15]；N-亚硝胺含量：参考杨华等[16]的方法，采用SPME装置进行样品前处理，结合气相色谱仪检测9 种挥发性N-亚硝胺的含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件整理实验数据，SigmaPlot 12.5绘图软件作图，Statistix 8.1软件分析标准偏差。

2 结果与分析

2.1 包馅鱼肉卷馅加工过程中的各项理化指标变化

表1 包馅鱼肉卷馅加工过程中的理化指标变化Table 1 Physicochemical changes during the processing of stuffed fi sh roll fi lliinngg

由表1可知，包馅鱼肉卷馅的原料中鸡小胸的TVB-N含量为（11.86±0.40） mg/100 g，鸡皮中未检出TVB-N。加工过程中添加肉精膏使馅料的TVB-N含量显著增加至（13.41±2.80） mg/100 g，但盐擂时的TVB-N含量降至（8.11±0.20） mg/100 g，终成品馅料的TVB-N含量更低，仅为（4.07±0.30） mg/100 g。

包馅鱼肉卷馅的主要原料鸡小胸的TBARs值为（0.05±0.01） mg/kg，鸡皮中为（0.17±0.02） mg/kg，表明二者的脂肪氧化水平均很低；但经过斩拌以后（添加少量肉精膏后），馅料的TBARs值显著增加至（0.72±0.02） mg/kg，进一步盐擂后馅料成品的TBARs值继续上升至（1.12±0.20） mg/kg，表明斩拌和盐擂使鱼肉卷馅料发生了脂肪氧化。原因可能是斩拌及盐擂过程中，原料中的油脂与空气频繁接触，发生了初级氧化，产生丙二醛等小分子物质[17]。

包馅鱼肉卷馅加工过程的亚硝酸盐含量始终较低，为0.46～1.83 mg/kg，馅料成品中的含量只有（1.93±0.20） mg/kg，这一水平与肉中天然存在的亚硝酸盐含量相当[18]。包馅鱼肉卷馅料的亚硝酸盐含量在加工过程中逐渐增加（从（0.46±0.10） mg/kg到（1.93±0.20） mg/kg），这可能是由于部分硝酸盐在加工过程中被还原成为亚硝酸盐[7]。

2.2 包馅鱼肉卷馅加工过程中的N-亚硝胺含量变化

由表2可知，在包馅鱼肉卷馅主要原料中共检测出4 种N-亚硝胺。NDMA仅在原料油葱中检出，含量为（27.51±5.10） μg/kg；NDEA在原料油葱、SH-52和玉米淀粉中检出，含量分别为（3.39±1.80）、（0.38±0.10）、（0.11±0.00） μg/kg；各原料中均检出NMEA，原料SH-52中NMEA含量最高，为（4.33±0.60） μg/kg，其次为玉米淀粉，含NMEA（1.71±0.40） μg/kg，其他原料油葱、鸡皮、6号胶及鸡小胸中的NMEA含量分别为（0.49±0.20）、（0.12±0.00）、（0.11±0.00）、（0.17±0.10） μg/kg。岳雷等[19]在鸡腿肉中并未检出NMEA，但检出NDEA、NPIP和NPYR，这可能是由于不同部位鸡肉中N-亚硝胺的种类及含量有差异。NDPheA仅在原料6号胶中检出，含量为（0.82±0.30） μg/kg。

表2 包馅鱼肉卷馅主要原料中的N-亚硝胺含量Tabllee 22 N-nitrosamine contents in the main ingredients of stuffed fi sh roll fi lliinngg

图1 包馅鱼肉卷馅加工过程中的N-亚硝胺含量变化Fig. 1 Changes in N-nitrosamine contents during the processing of stuffed fi sh roll fi lling

由图1可知，NDMA含量在添加肉精膏后最高，为（11.4±1.9） μg/kg，添加色素后其含量有所下降，为（4.8±1.1） μg/kg，鱼肉卷馅成品中NDMA含量最低，为（1.9±0.2） μg/kg。NDEA在添加肉精膏后含量最高，为（4.0±1.2） μg/kg，加色素后含量下降，成品中含量明显降低，为（2.5±0.4） μg/kg。NMEA在添加肉精膏后含量最高，为（13.7±2.1） μg/kg，加入色素进行斩拌后其含量变化不大，馅料成品中NMEA的含量降至（6.1±1.2） μg/kg。说明3 种N-亚硝胺的含量在加工过程中逐渐降低。

2.3 包馅鱼肉卷皮加工过程中的各项理化指标变化

由表3可知，原料带鱼浆的TVB-N含量为（4.65±0.20） mg/100 g，乳化鸡皮的TVB-N含量为（0.74±0.40） mg/100 g，较低的TVB-N含量表明原料很新鲜。盐擂后鱼肉卷皮的TVB-N含量较原料显著增加至（10.86±0.90） mg/100 g，这可能是离子强度增加、温度上升和内源酶作用的结果[20]。添加鸡皮乳化后鱼肉卷皮的TVB-N含量继续增加至（11.75±0.80） mg/100 g，但在添加可增强鱼糜制品凝胶特性的变性淀粉SH-52和6号胶后，鱼肉卷皮的TVB-N含量显著下降。煮制完成后，终成品的TVB-N含量为（7.36±0.30） mg/100 g。总体而言，包馅鱼肉卷皮加工过程中的TVB-N含量呈先上升后下降的趋势，但其含量始终较低。

肉中脂肪氧化产生的小分子物质能与TBA反应生成TBARs，TBARs值常用来表示脂肪氧化程度[21]。原料带鱼浆的TBARs值较低，为（0.36±0.00） mg/kg，乳化鸡皮的TBARs值较高，为（0.95±0.10） mg/kg，这可能是由于乳化鸡皮中脂肪含量丰富，容易发生氧化。包馅鱼肉卷皮在斩拌过程中的TBRAs值随着加入物质而波动，这种波动可能与所加物质的氧化性和抗氧化性以及体系中脂肪和氧化还原物质的可接触性有关。蒸煮后成品的TBARs值由（0.30±0.10） mg/kg显著上升至（0.86±0.00） mg/kg，表明加热促进了脂肪氧化[22]。

包馅鱼肉卷皮的原料带鱼浆、乳化鸡皮中的亚硝酸盐含量分别为（2.92±0.20）、（2.04±0.10）mg/kg，斩拌过程中亚硝酸盐含量缓慢上升，但始终低于4.00 mg/kg。

2.4 包馅鱼肉卷皮加工过程中的N-亚硝胺含量变化

由表4可知，包馅鱼肉卷皮各主要原料中检出的挥发性N-亚硝胺主要有NDEA、NMEA、NPIP和NDPheA，并未检出危害性最强的NDMA。添加剂虾肉卷诱惑红中NDEA含量最高，为（12.56±3.10） μg/kg；虾肉卷红曲红和I＋G中NDEA含量较高，分别为（5.16±1.70）、（3.62±1.20） μg/kg；其他原料中NDEA含量均低于3.00 μg/kg，其中6号胶、乳化浆及乳化鸡皮中并未检出NDEA。NMEA在添加剂虾肉卷诱惑红中含量最高，为（15.26±2.50） μg/kg；原料I＋G、SH-52以及增味剂中NMEA含量较高，分别为（5.48±1.40）、（4.33±0.60）、（3.27±1.10） μg/kg；其余原料中NMEA含量均低于3.00 μg/kg。NPIP仅在原料I＋G中检出，含量为（8.13±1.40） μg/kg。NDPheA仅在原料6号胶中检出，含量为（0.82±0.30） μg/kg。

我国国家标准GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[23]规定：肉以及肉制品中NDMA的含量不超过3.0 μg/kg，水产动物及其制品中的NDMA含量不超过4.0 μg/kg，而对其他食品中N-亚硝胺的限量标准没有明确规定。总体而言，包馅鱼肉卷皮各种原料中的N-亚硝胺含量符合国家标准，但因含有少量挥发性N-亚硝胺，其潜在的危害性不容忽视。

图2 包馅鱼肉卷皮加工过程中主要挥发性N-亚硝胺的含量变化Fig. 2 Changes in N-nitrosamine contents during the processing of stuffed fi sh roll skin

在包馅鱼肉卷皮加工关键工艺点取样分析，考察加工过程中各种N-亚硝胺的含量变化。由图2可知，包馅鱼肉卷皮中只检测到NDEA和NMEA，而NDPA、NPIP、NDPheA、NMOR、NDBA及NPYR均未检出。包馅鱼肉卷皮中NDEA和NMEA的含量在加工过程中呈先上升后下降的趋势，盐擂时，二者的含量均达到最高值，在加入乳化鸡皮快速斩拌（乳化）、加入6号胶进行斩拌后，二者含量均明显下降，加入SH-52以及加热制成品环节对2 种N-亚硝胺含量影响不大。

3 讨 论

包馅鱼肉卷的皮和馅的原料中分别含有少量的挥发性N-亚硝胺，在加工过程中挥发性N-亚硝胺快速生成，尤其是NDMA、NMEA和NDEA经过盐擂阶段快速积累。

盐擂是在鱼糜中加入适量食盐、白砂糖、葡萄糖等小料，并斩拌均匀的过程。盐擂的主要目的是增加肌原纤维蛋白溶解性，改善鱼糜的凝胶特性，但这一过程为N-亚硝胺的生成提供了底物和反应条件。首先，鱼糜制品富含内源酶，在斩拌过程中肌原纤维蛋白溶解性增强，更易被水解酶类降解，并进一步在转氨酶作用下生成胺类，本研究检测到斩拌过程中鱼肉卷TVB-N含量升高，与这一推测相吻合。二级胺是形成N-亚硝胺的直接底物[24-25]，能够促进其合成。另外，斩拌的机械力可以破坏肉中的肌纤维膜系统，使脂类物质充分与氧气接触，加快脂肪氧化[12]。本研究也检测到馅和皮在加工过程中TBARs值呈现明显上升趋势。而研究表明，脂肪氧化产生的丙二醛等可以促进N-亚硝胺的形成[1]。此外，蛋白质的氧化也会增加N-亚硝胺的合成[26]。另一方面，尽管在肉馅斩拌过程中采取了控温措施，但斩拌过程中温度高于4 ℃且略有上升[27]，这一条件下N-亚硝胺仍可缓慢合成[28-29]。N-亚硝胺含量在加工后期（乳化、加胶、成型）均呈下降趋势，一方面是由于这些加工过程不断加入其他原料（冰水等），降低了体系中物质的质量浓度。另一方面，NDMA和NMEA等N-亚硝胺有挥发性，可能随着加工的进行而挥发[30]。因此终产品中每种N-亚硝胺的含量并不高（1.90～8.63 μg/kg），其中危害性较大的NDMA，在鱼肉卷成品馅料中含量为（1.9±0.2） μg/kg，而在皮中并未检出，符合国家限量标准。

鱼糜制品不属于人为添加亚硝酸盐的腌制品，但其易生成胺类物质，可与原料中微量的亚硝酸盐反应，生成少量N-亚硝胺。尽管鱼糜制品中N-亚硝胺含量并不高，但其对消费者的潜在危害不容忽视。目前，对于鱼糜制品中N-亚硝胺的分析和控制研究并不多见。鉴于鱼糜制品在中国消费量巨大，建议研究人员开展研究，优化鱼糜制品加工工艺，尤其是加强对于盐擂过程的控制，评价和开发适用于鱼糜制品的亚硝化抑制剂[31]。

4 结 论

包馅鱼肉卷馅的原料中含有NDMA、NMEA和NDEA 3 种挥发性N-亚硝胺，皮的原料中挥发性N-亚硝胺主要有NDEA和NMEA。包馅鱼肉卷馅和皮加工过程中的TVB-N含量均逐渐降低，而TBRAs值和亚硝酸盐含量逐渐升高。盐擂是鱼肉卷中N-亚硝胺形成的主要环节，建议在实际生产中加强对盐擂温度的控制，并开发适用于鱼糜制品的N-亚硝胺抑制剂[31]，从而降低鱼糜制品中N-亚硝胺的含量，提高其食用安全性。