秀珍菇原生质体高效制备与再生研究*

崔 晓，丛倩倩，王庆武，安秀荣

（泰安市农业科学研究院食用菌研究所，山东 泰安 271000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 又名袖珍菇，学名为肺形侧耳。20世纪后期由台湾地区引进[1]，属真菌门 （Mycobionta） 担子菌纲 （Homobasidiomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 侧耳科 （Pleurotaceae） 侧耳属（Pleurotus）[2]。因其外形近似平菇，子实体朵形较小，在部分地区又被称为“小平菇”。秀珍菇质地脆嫩，味道鲜美，且营养丰富，其不仅富含人体所需的氨基酸等营养物质，从中提取的多糖更具有抗肿瘤功效[3]。秀珍菇的市场前景广阔，也为食用菌育种工作提供了优良亲本。

原生质体育种是食用菌育种工作的重要内容，早期的原生质体分离主要采用机械法破除细胞壁，自英国学者Cocking发明了酶解法[4]后，开创了大量获得原生质体的新技术。多年来，酶解法制备原生质体广泛用于食用菌研究中。1972年，Vries和Wessels[5]用裂解酶酶解得到了裂褶菌原生质体。1989年毛木耳和黑木耳通过种间原生质体融合得到新品种[6]，90年代以来上海市农科院通过原生质体单核化技术杂交得到香菇品种“申香”系列[7－9]。在食用菌研究中，原生质体的制备不仅在育种[10－14]中起着基础研究作用，同时也为菌种脱毒复壮[15－16]提供了新思路。

目前对秀珍菇原生质体的研究较少且着重在原生质体制备单因素方面[17－18]，本试验采用多因素正交组合的方法，明确了秀珍菇原生质体的最佳制备条件，并得到秀珍菇原生质体再生最适宜的培养基。以期建立秀珍菇原生质体的高效制备转化体系，为后续细胞水平的育种工作和其他遗传研究提供科学依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

供试菌株为夏秀，引自江苏省农业科学院，如图1。

图1 秀珍菇菌株夏秀子实体Fig．1 Fruitbody of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

1.2 试剂试剂

溶壁酶（lywallzyme）[19]，购自广东省微生物研究所；蜗牛酶（snailase），购自索莱宝（Solaibio） 公司；纤维素酶（cellulase），购自索莱宝（Solarbio）公司。

注射器中放入厚2 cm左右的脱脂棉，高压灭菌后备用。

1.3 培养基

PDA（马铃薯葡萄糖培养基） 培养基：马铃薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g、琼脂20g，加水定容至1L。使每平板定量为20mL。

TB3[20－21]再生培养基：酵母提取物3 g、酸水解酪蛋白3 g、蔗糖200 g、葡萄糖10 g、琼脂8 g，加水定容至1 L。

改良PD培养基：马铃薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 5 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g，加水定容至1 L。

2 试验方法

2.1 酶液配制

以溶壁酶稳渗剂为试剂，配置成浓度（W·V－1）为1%、1．5%、2%、2．5%、3%的酶液，在无菌条件下用0．22 μm的微孔滤膜过滤除菌备用。

2.2 稳渗剂配制

以蔗糖、甘露醇、MgSO4·7H2O、KCl为溶质，配制浓度（n·V－1）为0．6 mol·L－1稳渗剂溶液，高压灭菌后备用。

2.3 原生质体的制备

首先将菌种母种在斜面培养基（PDA） 上进行活化，25℃培养数天后转接到改良PD培养基中培养5 d，再将其置于50 mL离心管中6 000 r·min－1～10 000 r·min－1离心 15 min，去掉上清。分别用无菌水清洗1次，稳渗剂清洗2次收集菌丝。按照菌丝湿重（500 mg） 和酶液（1 mL） 的比例添加酶液，然后在25℃下进行水浴酶解2 h。水浴过程中每15分钟振荡离心管，待酶解完毕时，吸取少量酶解液用血球计数板在显微镜下观察计数。原生质体如图2所示。

图2 秀珍菇菌株夏秀原生质体Fig．2 Protoplast of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

2.4 原生质体的纯化

在离心管中加入5倍～7倍稳渗剂以停止酶解反应。使用含有脱脂棉的注射器过滤除去菌丝，2 000 r·min－1离心15 min去掉酶液。得到的原生质体沉淀用稳渗剂清洗2次，即为纯化的原生质体悬浮液。

2.5 复合因素对原生质体制备的影响

采用正交试验，筛选秀珍菇原生质体制备的最佳条件组合。采用L9(34)正交表进行四因素三水平正交试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab．1 Factors and levels of orthogonal test

2.6 正交试验的验证

通过正交试验结果（各因素K值大小）得到理论最佳条件并进行验证。根据理论条件得到的原生质体浓度同正交试验中得到的直接最佳结果进行差异显著性试验。

2.7 原生质体的再生

用稳渗剂将原生质体悬浮液稀释至原生质体浓度到104数量级。然后将原生质体悬浮液接种到TB3再生培养基上进行培养。

接种再生方式有3种，a直接涂菌法：用移液枪吸取200 μL原生质体悬浮液滴到已冷却至完全凝固的再生培养基平板上；b单层混菌法：用移液枪吸取200 μL原生质体悬浮液加到冷却至40℃～45℃的TB3再生培养基中，混匀后倒入灭菌的平板中；c双层混菌法：用移液枪吸取200 μL原生质体悬浮液加到冷却至40℃～45℃的TB3再生培养基中，混匀后倒入TB3再生培养基平板中。封口后用手转动平板至悬浮液均匀布满平板。

用无菌水代替液体再生培养基，稀释原生质体悬浮液待原生质体涨破后涂平板作为对照，以消除菌丝片段形成菌落而产生的误差。每个处理重复5次，放置于25℃恒温培养箱中培养，待5 d左右菌落数不再增加时进行统计，比较原生质体的再生情况。原生质体再生率（P）的计算公式为：

P（%） =(n1-n2)×100/n

式中：n1表示原生质体再生菌落数；n2表示对照平板中菌落数；n1-n2表示绝对再生菌落数；n表示涂布的原生质体数。

2.8 数据处理

相关数据采用Excel 2010进行整理并进行方差分析，每个处理5次重复。采用Duncan’s新复极差法统计分析。

3 结果与分析

3.1 供试菌株夏秀的栽培特性

如图1所示，夏秀菌株的菇体较小，菌盖较厚，菌盖直径小于3 cm，菌盖厚0.4 cm～0.6 cm，灰白色至浅褐色，菌柄长5 cm～6 cm，菌柄粗0.5 cm～1.3 cm，子实体散生。菌丝生长温度为10℃～35℃，最适宜生长温度25℃～30℃；子实体生长温度为10℃～32℃。属秀珍菇中的中高温品种，优点突出[22]。

3.2 复合因素对原生质体制备的影响

对菌龄、酶解时间、酶解温度、稳渗剂种类4个因素进行正交试验，通过上述单因素试验得到最佳单因素条件，以之为基础确定正交试验的3个水平值，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验。综合评价如表2所示。

根据K值大小，得到秀珍菇原生质体制备的最佳条件组合为A2B2C3D2，即：菌龄5 d、酶解时间4 h、酶解温度30℃、0.6 mol·mL-1甘露醇为稳渗剂。

表2 L9(34)正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

R值越大，说明因子对所得原生质体的浓度影响越大。极差分析结果表明，4个单因子的影响顺序为：D＞C＞A＞B，即稳渗剂种类对秀珍菇原生质体浓度影响最大，酶解温度、菌龄居次，酶解时间影响最小。

3.3 正交试验的验证

L9(34)正交试验验证结果见表3。

表3 验证试验结果Tab.3 Results of verification test

由表 3 可知，T=127．35，μ=T/9 （14．15），正交试验中直接最佳结果为试验7，在A3B1C3D2条件下，可得秀珍菇原生质体浓度为 3．39×107个·mL－1；根据K值可得正交试验理论最佳条件为A2B2C3D2，根据此条件制备秀珍菇原生质体，其浓度为4．23×107个·mL－1。同时由表3可知，3个数值中正交试验理论最佳条件所得的数值最大，且与其他二者呈显著性差异。

3.4 原生质体的再生

原生质体的再生情况见图2、表4。

图2 秀珍菇菌株夏秀原生质体的再生Fig．2 Protoplast regeneration of Pleurotus pulmonariusstrain Xiaxiu

表4 不同接种方式对夏秀原生质体再生的影响Tab．4 Effects of different inoculation method on protoplast regeneration of Pleurotus pulmonarius strain Xiaxiu

原生质体的接种方式对原生质体再生率的大小具有一定影响，3种接种方式所得的夏秀原生质体再生率大小为：b＞a＞c，其中采用单层混菌法接种原生质体再生率最大为2．35%。

4 讨论

在秀珍菇原生质体制备过程中有多个影响原生质体分离的因素，如果将所涉及的多个因素一一组合进行试验，工作量过大且效率太低。因此，引入正交试验方法是十分必要的。

原生质体制备的本质是通过酶解破除细胞壁使原生质体游离出来，因此酶的选择是至关重要的。在食用菌侧耳属相关介绍中，多采用溶壁酶、纤维素酶、蜗牛酶，或者多种酶混合进行试验。本试验中，以上述3种酶作为试验对象。纤维素酶的效果较差，镜检时能看到未充分溶解的方形晶体。而植物原生质体制备时，纤维素酶效果较好[23－24]。笔者推测原因有2个，一是真菌细胞壁的成分复杂，纤维素酶作为单一酶类无法破壁完全，二是纤维素酶的溶解条件和夏秀的酶解条件（如稳渗剂的选择及浓度）不同且存在一定差距，从而影响了纤维素酶的酶解效果。

本试验通过最佳制备条件得到的夏秀原生质体最大浓度为 4．23×107个·mL－1，介于万南安[17]与于清伟[18]所得结果之间。分析具体原因有2个，一是所选取的秀珍菇品种不同，造成得到的结果不同。万南安和于清伟选取的秀珍菇品种同本试验的试验对象夏秀为不同品种，品种的差异造成菌丝原生质体制备时具体浓度和影响条件不同。但各因素的总体趋势基本一致。所得的原生质体浓度随着酶浓度的升高、酶解时间的延长呈现先上升后下降的趋势。这进一步启示我们，是否不同品种的秀珍菇或其他种类食用菌，都会呈现不同的生物学特性和不同的原生质体制备条件。那么原生质体的制备是否和其自身的生物学特性具有某种相关性。二是前两者都是只进行了单因素试验且都采用多因素逐项试验设计，即将前一步得到的单因素A最优值代入后一步单因素试验B中。而前一步单因素最优值的结果影响下一步单因素试验的结果，即单因素试验顺序的选择影响最终试验结果，进一步证明正交试验的必要性。

原生质体的再生接种方式是影响原生质体再生率的重要因素[25]，本试验采用单层混菌法将原生质体悬浮液接种到TB3培养基中所得的再生率为2．35%，明显高于其他作者关于秀珍菇原生质体再生率0．85%的试验结果[17，26]，具体分析原因，一是接种方式的选择，单层混菌法的接种方式优势明显，其结果高于直接涂菌法和双层混菌法。二是接种后个人操作方法，接种后大多选择用涂布棒进行涂布，而涂布棒会对原生质体造成机械损伤，使原生质体破裂，本试验在接种封口后，用手轻轻转动平板，使原生质体分布均匀，避免损伤。三是再生培养基的选择，笔者在预试验中选用PDA、TB3、MYG（麦芽糖酵母膏）再生培养基，发现TB3的再生率高出其他2种。

无机盐、糖类和糖醇都是秀珍菇原生质体制备时适宜的渗透压稳定剂，不同稳渗剂对原生质体制备、再生有很大的影响。本试验中，有机类溶液作为稳渗剂效果优于无机稳渗剂。与何小慧[27]、王金斌等[28]的试验结果相同。

5 结论

原生质体的分离和再生是两个相互联系的过程，原生质体的制备浓度和再生率的大小是影响后续原生质体转化试验的重要因素[29－30]，而本试验通过单因素和正交试验相结合的方法，确定了秀珍菇原生质体制备的最佳条件为：秀珍菇菌丝在改良液体PD培养基中摇瓶培养 5 d，以 0．6 mol·mL－1甘露醇为稳渗剂，2．5%溶壁酶按酶液和菌丝（湿重）为2∶1的体积质量比混合在30℃条件下水浴4 h，所得原生质体浓度最大，浓度为 4．23×107个·mL－1。各因素的影响顺序为稳渗剂种类＞酶解温度＞菌龄＞酶解时间。通过单层混菌法接种原生质体于TB3再生培养基，再生率最高，为2．35%。