秦巴山区黑木耳新菌株森盛1号选育研究*

2018-09-22谢海彬王帮庆解修超赵赟鑫马明元邓百万

中国食用菌 2018年5期

谢海彬，王帮庆，解修超，赵赟鑫，马明元，邓百万**

（1．汉中植物研究所，陕西汉中 723000；2．陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；3．陕西森盛菌业科技有限公司，陕西勉县 724200）

黑木耳（Auricularia auricula）是我国栽培最早的食用菌，营养保健价值高，为我国第三大食用菌，产业发展迅速[1－4]。秦巴山区地理位置优越，黑木耳种质资源和林木资源丰富，但符合区域特点的黑木耳品种缺乏，亟需选育出优良品种来满足本地区黑木耳产业发展的需求。“森盛1号”是通过野生黑木耳菌株分离与系统选育而成；经过区域试验和生产试验，该品种具有中早熟、丰产、单耳、抗逆性强的特性，已经通过陕西省农作物品种审定委员会的审定。

1 材料和方法

1.1 菌株

试验采用的8个菌株由分布于秦巴山区不同生态条件下的野生黑木耳标本经组织分离和纯化培养获得[5]，并以当地主栽品种A268、新科5号为对照（CK），菌株具体来源见表1。

表1 试验菌株来源Tab．1 Sources of test strains

1.2 选育过程

选育工作按常规育种程序进行，即从收集到的野生菌种资源开始，经组织分离、菌种培养、生理性能测定、初筛、复筛、区别性鉴别、DUS（一致性和稳定性）属性研究等，综合评价确定入选菌株[6]。

1．2．1 品种比较试验

对分离的菌株首先通过菌丝生长速度和菌丝生长势等指标进行综合评价，再通过袋栽方式进行品种比较试验[7－10]。试验采用随机区组设计，每一个菌株为1个处理，每个处理100袋，设3次重复，记录不同菌株菌丝生长情况。

1．2．2 区域试验

2012年～2014年分别在宁强五郎庙（海拔约980 m）、勉县张家河（海拔约1 190 m）、略阳县九中金乡中川坝村（海拔约860 m）、四川青川县姚渡阳山村（海拔约490 m）、西乡县沙河镇（海拔约580 m）等地布点，开展品种区域试验。采用比较设计，设段木栽培50架，段木规格为长100 cm～120 cm，直径8 cm～12 cm的阔叶树木棒。以A91#为试验菌株，当地主栽品种耳268作为对照，栽培管理水平略高于当地生产水平。以品种系统选育为主要方法，品比试验后，将选出的表现优良的菌株进行扩大试验。

1.3 黑木耳A91#菌株生物学特性研究

1．3．1 拮抗反应

拮抗反应适用于异宗结合的真菌种类，不同种类的拮抗反应形态特征不同，总体上可以分为隆起型（ridgy）、沟型（chimb）和隔离型（separate）三大类型（NY/T1098－2006食用菌品种描述技术规范）。拮抗反应有无的判断依据为农业标准NY/T1845－2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应。二者间有拮抗反应，则为不同品种。以选育的黑木耳新品种森盛1号为试验菌株，以目前国内部分黑木耳主栽品种为试验对照，在CPDA培养基平板上，28℃培养，分析黑木耳森盛1号新品种间的亲缘关系。

1．3．2 蛋白质电泳试验

以选育的黑木耳新品种A91#为试验菌株，目前国内部分黑木耳主栽品种为对照进行液体培养，制备营养菌丝进行蛋白质电泳试验，测定黑木耳A91#新品种的亲缘关系。在分离胶浓度为12．0%，浓缩胶浓度为5．0%的电泳条件下，对供试的10种黑木耳菌株的营养菌丝进行酯酶同工酶电泳，得到酯酶同工酶谱图，依据酶谱中酶带的差异绘制酯酶同工酶模式图。

1．3．3 DNA 分子指纹图谱研究

采用改进的CTAB法提取菌丝体基因组总DNA。选用通用引物ITS1和ITS4（TS1：5’－TCCGTAGGT GAACCTGC－3；ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATAT GC－3’）扩增 5．8S rDNA 及其两侧的 ITS1和 ITS2基因片段。将所测序列提交到NCBI进行Blast检索，下载同源性较高的数据，生成Fasta格式的文件。用Clusta－X软件对所得序列进行人工校正和比对分析。利用Mega5，按照N－J法聚类，选择1 000个重复做Bootstrap值分析，构建系统发育树。

2 结果分析

2.1 品种比较试验结果

不同菌株菌丝生长情况见表2，不同菌株农艺性状和产量比较见表3。

由表2和表3可以看出，通过系统筛选，黑木耳A91#菌株整体性状表现优良，菌株菌丝体洁白、浓密，菌落边缘整齐、均匀，气生菌丝发达，呈绒毛状。品种比较试验结果表明，A91#菌株菌丝体生长速度快，长势强，出耳早，耳片单生，生物转化率比对照（CK）高11．81%，表现突出。

表2 菌株菌丝生长情况Tab．2 Mycelium growth condition of strains

表3 黑木耳菌株农艺性状和产量比较Tab．3 Comparison of agronomic characters and yield of Auricularia auricula strains

2.2 区域试验结果

黑木耳A91#段木栽培试验产量结果见表4。

表4 黑木耳菌株A91#段木栽培试验的产量Tab．4 Yield of the strain A91#of Auricularia auricula in cutlog cultivation trial

表4结果表明，A91#菌株在段木栽培生产试验中，每架平均产量为5．716 kg（干重），比对照品种提高16．49%，增产显著。

A91#菌株经过品种比较试验、区域试验发现，该品种与目前在陕南毗邻地区栽培的黑木耳品种相比，具有遗传性状稳定，抗杂菌感染能力强，生物转化率高，质量好等优点。

2.3 黑木耳A91#菌株生物学特性研究

2．3．1 拮抗反应

黑木耳A91#菌株与部分黑木耳菌株的拮抗反应结果见图1。

图1 A91#菌株与部分黑木耳菌株间的拮抗反应Fig．1 Antagonistic response of A91#strain to some strains of Auricularia auricula

由图1可以看出，对峙培养试验显示，黑木耳A91#菌株与当地栽培的8个黑木耳栽培品种的菌丝间存在不同程度的拮抗反应，其中与新科5号、秦单3#、秦单4#、国兴1号间拮抗反应呈隔离型，与耳801间拮抗反应呈隆起型，与耳238、耳268、耳913间拮抗反应呈沟型。说明黑木耳A91#菌株与目前主栽品种有差异。

2．3．2 黑木耳菌株A91#的蛋白质电泳试验

10种黑木耳菌株的酯酶同工酶谱图见图2。

图2 10种黑木耳菌株的营养菌丝酯酶同工酶电泳图谱Fig．2 Electrophoretic patterns of mycelial esterase isozymes of 10 strains of Auricularia auricula

图2结果显示，供试10种黑木耳菌株的酯酶同工酶酶活性均较高。电泳谱图中共出现36条酯酶同工酶谱带，每一菌株的酶带在2条～5条之间，大多在3条～5条之间。其中，耳629、耳801都出现5个酯酶同工酶谱带，耳238、913#和国兴1号出现4个酯酶同工酶谱带，A91#、耳268、秦单3#、新科1号出现3个酯酶同工酶谱带，秦单4#谱带最少，只有2个同工酶谱带。10个黑木耳菌株出现10个不同的酶谱类型，没有相同的酶谱类型，其中A91#和耳268、耳238和耳913菌株的带型基本相同。10个供试菌株在Rf值0．615和0．510处都有2个共有酶带，这可能是黑木耳菌种的特征酶带。

2．3．3 黑木耳菌株A91#的DNA分子指纹图谱研究

将新科1#、耳629、秦单3#等13个高同源性的序列与新菌株A91#的相关基因序列构建系统发育进化树，见图3。由图3可见，A91#与黑木耳（NCBI登录号：JN712676）基因序列上同聚为一族，其相似度最高；与黑木耳（NCBI登录号HQ388383和HQ388355）距离较近。因此，本文所获得的新菌株A91#是黑木耳菌株。

3 结论

通过系统选育筛选出具有目标性状的菌株A91#，定名“森盛1号”。该品种属中熟品种，耳片单生，商品性状好，抗杂菌能力强。3年的区域试验和生产试验表明，森盛1号段木栽培每架平均产量为5．716 kg，比对照品种提高16．49%；森盛1号袋料栽培每100千克干料平均产鲜耳82．166 kg，比对照品种平均高15．35%。