机械牵张力加载时间对诱导正常皮肤成纤维细胞向增生性瘢痕成纤维细胞转化过程的影响研究

朱明宇 李雨珊 王志国

[摘要]目的：探究机械牵张力不同加载时间对诱导正常皮肤成纤维细胞（Normal skin fibroblasts， NSFB）向增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts， HSFB）转化的影响。方法：同一人体NSFB和HSFB分别设实验组和对照组，实验组加载0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力3d、5d、7d，对照组细胞均不加力。CCK-8法检测细胞增殖能力；SYBR Green qPCR法检测细胞p130Cas、Integrin-β1、转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达水平；ELISA法检测细胞上清液TGF-β1和Ⅰ型胶原含量；Western-blot法检测细胞Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表达水平。结果：机械牵张力加载5d时，NSFB实验组与HSFB对照组比较，细胞增殖水平及p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA表达水平相近，差异均无统计学意义（P>0.05）；加载3d、7d时，以上指标检测结果差异显著，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力加载5d可使NSFB表现出HSFB的部分生化特征，机械牵张力对NSFB向HSFB转化过程有明显的诱导作用。

[关键词]增生性瘢痕；机械张力；成纤维细胞；细胞转化

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）06-0055-05

Abstract： Objective To investigate the effect of mechanical stretch at different loading times on the transformation of normal skin fibroblasts （NSFB） into hypertrophic scar fibroblasts （HSFB）. Methods The same demic NSFB and HSFB were respectively divided into the experimental groups and the control groups. The experimental groups were loaded with 0.1Hz， 10% amplitude cyclic stretch 3， 5 and 7 days. The control groups were cultured without cyclic stretch. CCK-8 method was used to measure the cell proliferation. SYBR Green qPCR method was used to measure the expression of p130Crk-associated substance （p130Cas） ， Integrin-β1， transforming growth factor β1 （TGF-β1） ， type I collagen and Alpha-smooth muscle actin（α-SMA） . ELISA method was used to measure the content of type I collagen and TGF-β1 in culture supernatant. Western-Blot method was used to detect the content of protein Integrin-β1， p130Cas and α-SMA. Results With 5-days-long amplitude cyclic stretch， cell proliferation and expression of p130Cas， Integrin-β1， TGF-β1， α-SMA and type I collagen of the NSFB experiment group showed no significant difference with that of the HSFB control group（P>0.05）. With 3-days-long and 7-days-long amplitude cyclic stretch， the above indexes showed significant differences （P<0.05）. Conclusion The mechanical tension loading of 0.1Hz and 10% tensile amplitude 5d can make NSFB exhibit some biochemical characteristics of HSFB， and the mechanical tension can obviously induce the transformation of NSFB to HSFB.

Key words： hypertrophic scar； mechanical stress； fibroblasts； cell transformation

皮膚损伤后，创面周围的正常皮肤成纤维细胞（Normal skin fibroblasts， NSFB）增殖迁移，分泌转化生长因子-β（TGF-β）使NSFB向增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts， HSFB）转化，合成以Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白为主的细胞外基质修复组织，并分泌α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）使组织内纤维收缩，导致增生性瘢痕形成。临床研究发现，切口张力与增生性瘢痕形成呈正相关，表明机械张力是导致增生性瘢痕形成的重要因素[1-2]。实验研究发现，加载机械牵张力后的成纤维细胞有表现出HSFB某些表型的趋势。但是，由于缺乏相应增生性瘢痕成纤维细胞模型，机械张力诱导增生性瘢痕形成的具体机制尚未明确。前期研究表明，加载10%拉伸幅度的周期性机械张力时，NSFB会产生明显的机械传导效应和生化反应[3]，但加载时间对诱导NSFB向HSFB转化过程的影响尚未明确。本实验拟采用机械牵张力诱导NSFB向HSFB转化，观察不同机械牵张力加载时间对NSFB中各生化因子表达水平的影响，探究机械牵张力诱导NSFB向HSFB转化的最佳加载时间，为增生性瘢痕形成机制研究进程奠定前期必要基础，并提供重要实验支撑。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器：MEM Eagle培养基（CORNING公司，美国）、FBS、含EDTA的胰酶（Gibco公司，美国）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（同仁化学，日本）；TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒（R&D; Systems公司，美国）；TRIzol试剂（Ambion公司，美国）；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；Ⅰ型胶原、TGF-β1 、Integrin-β1、p130Cas、α-SMA及内参GAPDH PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成；p130cas、Integrin-β1、α-SMA兔抗人單克隆抗体（Abcam公司，英国），山羊抗兔二抗（Abgent公司，苏州），PVDF膜、ECL发光液（Millipore公司，美国）。

CO2培养箱（Panasonic公司，日本）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；多通道细胞应力加载仪（BF-3001C；Flex-cell公司，美国）；6孔弹性基底膜培养板（BF-3001C；Flex-cell公司，美国）；酶联免疫检测仪（BioTek公司，美国）；ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪（ABI公司，美国）；化学发光成像系统（ALPHA FCE公司，美国）。

1.2 细胞培养与分组：瘢痕组织及正常皮肤部真皮组织均取自接受瘢痕切除植皮术（青岛大学附属医院美容整形外科）的增生性瘢痕患者，共3例，患者本人均知情同意。患者瘢痕均有增生表现，外观呈红色或深红色，质硬，高于周围正常皮肤表面0.5cm以上，术前未进行抗肿瘤类药物、激素类药物或放射性治疗；正常皮肤真皮组织均取自患者正常腹部皮肤，该处皮肤无红肿，无硬结，无色素沉着。男1例，女2例，年龄分别为18、37、41岁。

按照文献应用组织块法体外培养成纤维细胞，取第3～8代细胞进行实验。同一例患者NSFB和HSFB分别设实验组和对照组。调整细胞悬液浓度至1×104个/ml，以2ml/孔均匀接种于6孔弹性基底膜培养板。于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，倒置显微镜下观察细胞融合度达30%后，更换培养基。根据前期研究皮肤成纤维细胞对10%拉伸幅度的机械张力产生最明显的机械传导及生化效应[3]，设置加载机械张力参数为拉伸幅度10%，加力频率0.1Hz，加力波形为正弦波。按加力仪说明书要求给予实验组细胞连续加力4h后停止1h，以此循环，每日加力时间不少于10h，加载机械张力的总时间分为3d组、5d组和7d组；加力环境仍为37℃、5%CO2及饱和湿度。对照组不加力，其余培养条件与实验组相同。每组实验重复3次。实验组和对照组细胞每隔2d每孔补充10%血清培养液0.5ml。

1.3 检测指标

1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖：4组分别于各时间点取3孔细胞，每孔加入CCK-8试剂200μl，轻摇培养板将试剂混匀后继续在培养箱中培养3h。分别取200μl细胞培养上清液，置于96孔板中，以不含细胞的培养基作为空白孔，用酶联免疫检测仪在450nm波长处检测吸光度值，以反映细胞数量。

1.3.2 ELISA法检测TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌量：收集各组培养板孔细胞上清液，按照TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒说明书进行操作，检测TGF-β1、Ⅰ型胶原含量。

1.3.3 SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的基因表达：各组取3孔细胞，Trizol法提取细胞总RNA，SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平。具体操作如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μl、PCR Forward Primer 0.8μl、PCR Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl、灭菌蒸馏水6μl，cDNA溶液2μl，总体系20μl，每样品重复3管；应用ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪进行扩增，调整反应条件，以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s重复45个循环。扩增完成后，应用ABI ViiA? 7软件对反应产物的熔解曲线进行自动定量分析。以GAPDH为内参，各引物序列见表1。采用相对定量法计算各目的基因mRNA含量，即根据Ct值计算2-ΔΔct 值。ΔΔCt=（Ct目的-Ct内参）-（Ct对照-Ct内参）。

1.3.4 Western-Blot法检测Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表达量：各组取3孔细胞，将蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂按100：1的比例制成混合溶液，裂解细胞30min后，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，测定后加入1/4样品体积量的Loading Buffer，95℃金属浴5min后室温备用。调整电泳参数，浓缩胶80V 30min，分离胶120V、60min。取出凝胶后湿转法转膜，转膜参数280mA 140min。Integrin-β1、p130Cas、α-SMA一抗稀释浓度为1：5 000；内参β-actin稀释浓度1：1 500；二抗稀释浓度1：10 000。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h后涂ECL发光液于化学发光成像系统中显影。用Image J图像分析系统测定蛋白条带的灰度值，以灰度值和条带面积的乘积（IntDen）进行半定量分析。蛋白相对表达量=实验组（IntDen目的-IntDen内参）/对照组（IntDen目的-IntDen内参）

1.4 统计学分析：采用SPSS 11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-Ka检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测细胞增殖活性：加载机械牵张力1d时，HSFB细胞增殖水平高于NSFB；随加载时间增加，各组细胞增殖能力增强，但实验组细胞增殖水平均高于对照组。加载3d时，HSFB各组增殖水平高于NSFB各组；加载5d时，NSFB实验组细胞增殖水平与HSFB对照组极为相近，差异无统计学意义（P>0.05）；加载7d时，NSFB实验组细胞增殖水平与HSFB对照组存在明显差距，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 不同时间机械牵张力对p130Cas、Integrin-β1蛋白及基因表达的影响：加载机械牵张力可使NSFB和HSFB的p130Cas、Integrin-β1表達水平提高；加载3d时，NSFB实验组的p130Cas、Integrin-β1基因与蛋白表达水平低于HSFB对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；加载5d时，NSFB实验组与HSFB对照组细胞p130Cas、Integrin-β1基因与蛋白表达水平极为接近，差异无统计学意义（P>0.05）；加载7d时，NSFB实验组细胞p130Cas、Integrin-β1基因与蛋白表达水平高于HSFB对照组，明显高于NSFB对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示加载机械张力5d时，NSFB实验组的P130Cas、Integrin-β1表达水平与HSFB对照组一致性最高。见图2，表2～3。

2.3 不同时间机械张力对TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA基因和蛋白表达的影响：加载机械牵张力可使NSFB和HSFB的TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA表达水平提高；加载3d时，NSFB实验组的TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA基因与蛋白表达水平低于HSFB对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；加载5d时，NSFB实验组与HSFB对照组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA基因与蛋白表达水平极为接近，差异无统计学意义（P>0.05）；加载7d时，NSFB实验组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA基因与蛋白表达水平高于HSFB对照组，明显高于NSFB对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明，在加载机械张力5d时，NSFB实验组的TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA表达水平与HSFB对照组一致性最高。见图3～5，表4。

3 讨论

在机械牵张力、细胞因子、炎症或感染等复杂因素作用下，创伤后组织容易形成增生性瘢痕。瘢痕愈合是机体修复一定程度的皮肤损伤的结果，主要表现为成纤维细胞分泌以胶原为主的细胞外基质修复损伤组织，且愈合组织过度纤维增生，影响机体功能和美观[4]。临床研究明确了张力与增生性瘢痕形成的关系，张力大的切口易形成增生性瘢痕[2]；体外细胞培养实验研究发现，NSFB在机械牵张力作用下可表现出HSFB部分特征[5]。由于缺乏相应的人类增生性瘢痕成纤维细胞模型，机械牵张力诱导增生性瘢痕形成具体机制研究进展缓慢。本研究对NSFB加载一定参数的机械牵张力，试图将其诱导转化为HSFB。

目前，细胞力学实验已成为国内外实验研究的热点，不同幅度、频率及加载时间的机械牵张力可诱导多种细胞发生生化反应及表型转化，例如，加载频率1Hz、20%拉伸幅度的机械牵张力时，血管内皮细胞的粘附分子增多，血管平滑肌细胞发生表型变化[6]；加载频率1Hz、8%拉伸幅度的机械牵张力48h后，肌腱成纤维细胞增殖率最高，且此时细胞分泌较多的纤连蛋白及基质金属蛋白酶-1[7]；加载频率1Hz、3%拉伸幅度的机械张力每天2次、每次1h，共3d，导致成骨细胞与肌腱成纤维细胞中参与骨整合与骨诱导的基因下调[8]。综上所述，加载一定频率、幅度及作用时间的机械牵张力会影响细胞的活性及生化反应，这也是不同细胞承受机械张力的前期生物学研究基础。目前对于诱导NSFB向HSFB转化的张力参数并未明确，前期研究已证实，加载10%拉伸幅度的周期性机械张力时，NSFB产生明显机械传导效应和生化反应[3]，但尚不清楚诱导NSFB向HSFB转化的加载时间参数。本研究的目的为探究诱导NSFB向HSFB转化的最佳时间，为研究增生性瘢痕细胞模型提供科学、完整的重要标准参数。

Integrin-β1、p130Cas是参与细胞内机械牵张力传导的重要分子。机械牵张力传导的重要途径是整合素（Integrin）信号通路，故细胞力学传导能力主要体现在整合素信号通路中各分子的表达水平上。整合素信号通路传导途径为：在受到机械牵张力作用后，细胞膜上的整合素受体活化，促使细胞内肌动蛋白聚集形成黏着斑[9]，粘着斑向外与整合素结合[10]，向内与细胞骨架感受器p130Cas相连[11]，通过其自身的形变将机械牵张力信号由细胞外传导至细胞骨架[12]；细胞骨架又与细胞核膜相连，信号便通过细胞核膜上受体的传导进入细胞核[13]；接收到信号的细胞核则在基因水平上调控转录、翻译，产生一系列生化反应[14]。本研究发现：虽然各组细胞的整合素和p130cas表达水平均与加载机械牵张力时间成正相关，但在加载机械牵张力5d时，NSFB内整合素和p130cas表达水平已相当接近未加载的HSFB内水平，这表明当加载机械牵张力5d时NSFB在力学信号传导能力上同HSFB相近。

机械牵张力可诱导NSFB转化为HSFB[15]。与NSFB相比，HSFB合成细胞外基质的能力较高，突出表现在TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA等重要分子标志物的表达水平较高[16]。TGF-β1是NSFB向HSFB转化的关键刺激因子，可协同机械牵张力的刺激作用促使细胞表达α-SMA，以增强成纤维细胞收缩力；TGF-β1可刺激细胞外基质中Ⅰ型胶原的分泌，同时抑制其降解[17]，以促进组织愈合，刺激纤维增生。此外，HSFB具有优于NSFB的细胞增殖能力。本研究结果显示，在加载0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力5d时，NSFB内TGF-β1、Ⅰ型胶原、α-SMA的表达水平及细胞增殖能力与未加载机械张力的HSFB极为相近，这证实当加载机械牵张力5d时NSFB具有同HSFB相近的生化反应及细胞增殖能力。

综上所述，加载0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力作用5d时，NSFB表现出HSFB的典型特征，诱导转化的最佳加载时间为5d，可作为标准力学模型参数进一步研究增生性瘢痕形成机制及治疗方法。此外，在加载机械牵张力7d时，NSFB的各分子表达水平已超出未加载机械牵张力的HSFB，虽然不可否认此时的NSFB未停止向HSFB转化，但已超出正常HSFB的标准表征，可能会发生过度转化，仍需进一步实验研究过度加载机械牵张力会对成纤维细胞产生何种功能上的影响甚至表型的影响。

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[收稿日期]2018-01-29 [修回日期]2018-05-15

編辑/朱婉蓉