肌红蛋白在纳米金—石墨烯复合材料修饰电极上的电化学研究

何博琳，汪晓玲，门永玲，谢 慧，罗贵铃，牛燕燕，孙 伟

(海南师范大学 化学与化工学院 海口市功能材料与光电化学重点实验室，海南 海口 571158)

利用纳米材料制备化学修饰电极具有比表面积大、导电性高等特点，有利于加快电子转移速度[1]。石墨烯(Graphene)是由单层碳原子紧密堆积而成、呈二维蜂窝状晶格结构的新型碳材料，具有优异的电学、热学和力学等性能，其平面结构为负载纳米金属提供了足够的表面，相应的石墨烯复合材料性能有更大的提高[2]。纳米金具有高比表面积、强吸附性以及良好的导电性和生物相容性等，可以将生物分子有效地固定且不影响其生物活性，在电化学分析和电化学生物传感器中得到了广泛的应用[3]。

本文利用负载纳米金粒子石墨烯(rGO@Au)制备了肌红蛋白(Mb)电化学传感器。该纳米复合材料展示了纳米金与石墨烯良好的协同作用，Mb在传感界面上得到良好的固定并且保持其生物活性。实验结果表明rGO@Au具有良好的生物相容性，有效加快Mb的电子转移，所制备的电化学传感器对三氯乙酸表现出良好的催化效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JSM-7100F热场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；CHI 660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。负载金属纳米金粒子石墨烯(rGO@Au，南京先丰纳米科技有限公司)；肌红蛋白(Mb，Sigma公司)；N-己基吡啶六氟磷酸盐 (HPPF6，兰州雨陆精细化工有限公司)；石墨粉(上海胶体化工厂)；三氯乙酸(TCA，天津市科密欧化学试剂开发中心)；5% Nafion (北京鸿海天科技有限公司)。

1.2 Nafion/Mb-rGO@Au/CILE的制备

将石墨粉和HPPF6混合均匀导入玻璃电极管中，内插铜丝为导线，得到碳离子液体电极(CILE)[4]。配制含rGO@Au浓度为0.6 mg/mL和Mb浓度为15.0 mg/mL的混合液，取6 μL涂布于CILE上室温干燥后进一步滴涂8 μL 0.5% Nafion溶液，自然晾干后制得Nafion/Mb-rGO@Au/CILE。

2 结果与讨论

2.1 电极表征结果

用扫描电镜记录rGO@Au的形貌结果如图1(A)所示，可以看出典型的石墨烯片状构型，并在其表面均匀分散纳米金颗粒。这种结构增大了电极界面的比表面积，有利于Mb在电极表面的固定及其与电极之间的电子传递。电化学交流阻抗谱 (EIS) 结果图1(B)所示，Nafion/Mb/CILE (曲线a)的阻值为57.97 Ω，而Nafion/Mb-rGO@Au (曲线b)的阻值为39.05 Ω，电阻值明显的减小说明rGO@Au复合材料有高导电性，有效加快电子转移。

图1 (A)为rGO@Au的SEM图，(B)为Nafion/Mb/CILE(a)和Nafion/Mb-rGO@Au/CILE(b)在10.0 mmol/L铁氰化钾和0.1 mol/L氯化钾混合液中的电化学交流阻抗谱

Fig.1 (A) SEM of rGO@Au; (B) EIS results of (a) Nafion/Mb/CILE and (b) Nafion/Mb-rGO@Au/CILE

2.2 Mb的直接电化学行为

图2(A)为在pH 5.0 PBS缓冲液中不同修饰电极的循环伏安曲线。在Nafion/CILE (曲线a)和Nafion/rGO@Au/CILE (曲线b)上没有出现氧化还原峰，表明电极上不存在电活性物质，背景电流的增大说明具有片状结构的rGO@Au增加了双电层电容。在Nafion/Mb/CILE (曲线c)上有一对较小的氧化还原峰出现，表明Mb与电极间存在较慢的电子转移。而Nafion/Mb-rGO@Au/CILE (曲线d)上出现了一对较为对称且准可逆的氧化还原峰，表明rGO@Au在电极表面使得电极反应更为可逆，高导电性的rGO@Au加快Mb的电子转移，实现了蛋白质的直接电化学。

探讨了扫速对Mb直接电化学响应的影响。如图2(B)所示，在20～900 mV/s扫速范围内Mb均表现出了一对氧化还原峰。扫速的增大会引起峰电流的增大，两者间呈线性关系，表明修饰电极上发生了吸附控制的薄层电化学行为。由公式Q = nAFΓ*计算出电活性物质表面覆盖度Γ*= 3.54×10-10mol/cm2，较之单层覆盖量(1.58×10-11mol/cm2)更高[5]。随着扫速的加快峰电位差也逐渐增大，其线性方程为Epc (V) = 0.056 ln υ (V/s) - 0.12 (n = 8, γ = 0.969)和Epa (V) = -0.045 ln υ (V/s) - 0.34 (n = 8, γ = 0.988)。根据Laviron理论[6]，求解了电子转移数n = 1.02，电子传递系数α = 0.56。反应速率常数ks = 0.72 s-1，较之其他文献值如CS-GR-IL/CILE (0.65 s-1)[7]，GR-Pt/CILE (0.58 s-1)[8]更大，说明rGO@Au修饰电极中Mb的直接电子转移具有较快反应速率。

图2 (A)不同修饰电极在pH值5.0 PBS缓冲液中，扫速为0.1 V/s的循环伏安曲线； (B)不同扫速下的循环伏安图

Fig.2 (A) CVs of (a) Nafion/CILE, (b) Nafion/rGO@Au/CILE, (c) Nafion/Mb/CILE, (d) Nafion/Mb-rGO@Au/CILE in pH 5.0 PBS with the scan rate as 100 mV/s; (B) CVs of Nafion/Mb-rGO@Au/CILE with different scan rates

2.3 修饰电极的电催化应用

a 到 p为0.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100.0, 110.0, 120.0, 130.0 mmol/L

考察了修饰电极电催化还原TCA的效果。如图3所示，当TCA浓度在3.0～130.0 mmol/L范围内，Ipc随其浓度的增大而增大，Ipa则逐渐减少至消失，得到线性方程为Ipc (mA) = 0.0028 C (mmol/L) +0.049 (n = 11, γ = 0.995)。当TCA浓度大于130.0 mmol/L时出现转折点，为Michaelis-Menten动力学过程的典型特征[9]。根据Lineweaver-Burk方程，计算出修饰电极对TCA催化反应的表观米氏常数(KMapp)为7.60 mmol/L，检测限为0.63 mmol/L (3σ)。

2.4 样品的测定

根据标准加入法将修饰电极用于对医用换肤液(上海伊卡生物技术有限公司)中TCA含量的检测，结果如表1所示，回收率在95.10 %～103.07 %范围内，证明修饰电极对TCA样品测定具有较高的准确率。

表1 医用换肤液中TCA的检测结果 (n=3)

3 结论

通过直接涂布法制备Mb与rGO@Au修饰电极，并研究了Mb在复合膜内的电化学行为。循环伏安扫描结果表现为一对准可逆的氧化还原峰，修饰了rGO@Au纳米复合材料后提升了Mb与电极间的电子转移速率。进一步探讨了影响膜内Mb电化学响应的的因素，求解了相关的电化学参数，并应用于对三氯乙酸(TCA)电催化还原，结果较为满意。