益智不同部位化学成分及清除DPPH自由基活性比较

2018-09-18刘琳李生茂张帆张世鹏唐友爱

中国民族民间医药·下半月 2018年6期

刘琳　李生茂　张帆　张世鹏唐友爱

【摘要】目的：比较益智不同部位化学成分及清除DPPH自由基活性。方法：采用UV法和HPLC法对益智、益智仁和益智壳的化学成分进行定性分析，采用DPPH法评价其抗氧化活性。结果：益智和益智仁的UV、HPLC图谱较为相似，而与益智壳的差异明显；益智、益智仁和益智壳清除DPPH自由基的IC50依次为1.098、1.763和0.815mg/mL（相当于生药）。结论：益智和益智仁化学成分相似，益智壳化学成分与二者差异较大；益智、益智仁和益智壳均具有清除DPPH自由基的作用，其中益智壳作用最强。

【关键词】益智；不同部位；化学成分；DPPH

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）12-0023-04

Abstract：Objective To compare the chemical constituents and DPPH free radical scavenging activity of different parts of Alpiniae Oxyphyllae Fructus.Methods The chemical constituents of the fruit， seeds and peels were analyzed by UV and HPLC， and the antioxidant effect of all samples was determined by DPPH method. Results Both of the UV and HPLC spectral graphs of fruit and seeds were similar， which have great difference with the peels. The IC50 of the DPPH free radical scavenging was 1.098， 1.763 and 0.815mg/mL（crude drug）. Conclusion The fruit and seeds have similar chemical constituents， which have great difference with the peels. All samples had？DPPH free radical scavenging activity， and the peels had the strongest scavenging capacity.

Keywords：Alpiniae Oxyphyllae Fructus； Different Parts； Chemical Constituents；DPPH

益智為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq）的干燥成熟果实，具有暖肾固精缩尿，温脾止泻摄唾的功效[1]。研究显示益智含有萜类、黄酮类、二苯庚烷类等化学成分，具有神经保护、提高学习记忆、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、强心和镇静催眠等广泛的药理活性[2-6]。多部中国药典记载益智（完整果实）需除去外壳（益智壳）种子团（益智仁）入药或进一步炮制使用，而占益智果实重量约30%的外壳则作为废物丢弃，在一定程度上造成了益智药材资源的浪费[1，7，8]。目前，有关益智壳与仁的化学成分的比较研究多集中挥发油[9-12]、总黄酮、总多糖[12]和寡聚糖[13]等大类成分的含量测定以及挥发油[9-11，14]化学成分的分析。而采用HPLC法对益智仁与益智壳中整体化学成分的对比分析较少，且未见有其抗氧化活性比较研究报道。基于此，实验在前期研究基础上[6]，分别采用UV和HPLC对益智、益智仁和益智壳的化学成分进行对比分析，并采用DPPH法比较了抗氧化活性的差异，以期为更加合理利用益智药材资源提供一定实验依据。

1 仪器与材料

1.1 材料益智（批号：140101）药材购于南充五星金方中药饮片有限公司，经川北医学院药学院李毅主任中药师鉴定为姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq）的干燥成熟果实，益智药材剥开，人工分离得到益智仁和益智壳。1，1-二苯基苦基苯肼（批号：034K1071，sigma公司），甲醇（批号：201309230，成都市科龙化工试剂厂），水为超纯水（自制）。

1.2 仪器 Agilent1220高效液相色谱仪；KQ3200 DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司）；Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；Epoch 微孔板分光光度计（美国BIOTEK公司）；岛津1750紫外分光光度计（日本岛津公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备取益智不同部位样品粗粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL甲醇，称定质量，超声30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 益智不同部位样品UV分析取“2.1”项下方法供试品溶液，加适量甲醇稀释40倍，于紫外分光光度计在200～800 nm波长范围内进行光谱扫描，记录光谱图。整体而言，益智仁和益智UV图谱峰形较为相似，仅为吸收强度有所不同，但两者与益智壳在260～285 nm则差异明显，益智壳在该波长区间的吸光度更强、变化更缓慢，呈明显的平台。此外，益智、益智仁和益智壳在217 nm处均有一明显的吸收峰，吸收强度大小依次为益智壳、益智和益智仁。结果如图1所示。

2.3 益智不同部位样品化学成分HPLC分析

2.3.1 HPLC色谱条件[6] 色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）–0.4%磷酸水（B），梯度洗脱（0～15 min，35%A；15～32 min，35%～70% A；32～48 min，70%～77% A）；流量：0.6 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：250 nm；进样量：20 μL。

2.3.2 样品测定按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，进样分析，记录色谱图。结果显示，在同一色谱条件下，益智仁与益智HPLC色谱图相似性较高，仅存在个别色谱峰有无及部分色谱峰峰面积大小的差异。益智仁和益智壳HPLC色谱图则存在较大差异，益智仁HPLC色谱图中前30 min色谱峰数量远多于益智壳，而在37～39 min，益智壳则出现3个新的色谱峰。进一步通过与对照品比对，确认了样品HPLC色谱图中白杨素、杨芽黄素和圆柚酮的色谱峰。其中，白杨素和杨芽黄素在各样品中峰面积的大小顺序均为：益智壳﹥益智﹥益智仁，圆柚酮在各样品中峰面积的大小顺序为：益智仁﹥益智﹥益智壳，并且在该检测条件下，益智仁未检出杨芽黄素，结果如图2所示。

2.3.3 相似度分析采用由国家药典委员会开发的《中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件，选取中位数法自动匹配，对益智不同部位样品HPLC图谱数据进行分析，计算相似度。结果显示，益智仁与益智相似度较高，达0.990，而与益智壳相似度较低，为0.862，见表1。

2.4 益智不同部位样品清除DPPH自由基活性比较

2.4.1 DPPH溶液配制精密称取DPPH适量，加甲醇配置浓度为170 μmol/L溶液，避光保存。

2.4.2 清除DPPH自由基作用按“2.1”项下方法制备供试品溶液，加甲醇稀释成不同质量浓度（相当于生药量）的供试品溶液。取0.15 mL供试品溶液，与0.15 mL DPPH溶液置96孔板上，混匀后室温避光放置60 min，517 nm波长处测定吸收度Ai，同时测定0.15 mL甲醇与0.15 mL DPPH溶液A0，计算清除率，公式为：清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率（Y）对药物质量终浓度（X）进行对数回归，求出清除率为50%时药物的质量浓度（IC50）。结果见表2。

3 讨论

实验采用UV法对益智不同部位样品化学成分整体特征进行分析，发现益智仁和益智UV图谱更为相似，仅存吸收强弱的区别，但与益智壳的UV图谱部分特征峰的峰形、位置和吸收强度有明显不同，暗示益智和益智仁与和益智壳中所含化学成分的种类和含量存在较大差异。进一步采用HPLC法分析了益智不同部位的化学成分组成，直观发现益智仁与益智HPLC色谱图相似性较高，仅存在个别色谱峰数量及部分色谱峰峰面积大小不同；而益智仁与益智壳的HPLC色谱图区别明显，前者色谱图中色谱峰数量明显多后者色谱图中的，这与吴德玲等研究结果相似[12]。进一步通过对照品与HPLC图谱中部分色谱峰比对，发现益智中白杨素和杨芽黄素等黄酮类成分主要集中在益智壳中，而萜类成分圆柚酮则主要集中在益智仁中。相似度分析结果也显示，益智仁与益智相似度较高，达到0.990，益智壳与益智和益智仁相似度较低，相似度分别为0.903和0.862，该结果与直观分析结果较为一致。

清除DPPH自由基活性测定结果显示，益智、益智仁和益智壳均具有一定程度的清除DPPH自由基活性，但强弱有所不同，其中以非传统药用部位的益智壳清除DPPH自由基活性最强，值得进一步的开发利用。实验仅比较了益智仁和益智壳甲醇提取物清除DPPH自由基的活性，其清除DPPH自由基的活性成分以及对其它自由基是否具有清除活性尚有待进一步的研究。

参考文献

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