细叶结缕草褐斑病病原菌的分离、鉴定及杀菌剂 室内毒力测定

章 武，牛学礼,刘金祥,黄俊文，林金梅，黎宇婷

(1.岭南师范学院，广东 湛江 524048； 2.华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631)

草坪不仅在保护和美化环境方面发挥着重要作用，也是人们休闲、娱乐和进行体育锻炼的重要活动场所。随着人类社会与经济高速发展，高质量的草坪已成为现代化建设中必不可少的重要组成部分[1]。然而，草坪草在遭受一些病害侵染后会发生早衰甚至死亡，这不仅直接影响了草坪的观赏价值，还降低了其应用价值，给草坪产业造成了巨大的经济损失。加之草坪和绿地面积的不断扩大以及草坪的集约化管理程度逐渐提高，我国大量引进国外草坪草种子，导致草坪病害的发展也越来越严重，致使草坪使用年限减少，甚至衰败废弃[2]。

我国草坪业自20世纪80年代以来有了迅猛的发展，草坪工作者对我国各地草坪病害进行了详细的调查与鉴定[3-6]。翁启勇[7]整理了16类国内外已报道的结缕草属的真菌病害，病原隶属21个属，近30个种。刘晓妹等[8]报道了海南省结缕草病害有褐斑病(Rhizoctoniasolani)、白绢病(Sclerotiumrolfsii)、离孺孢叶枯及根腐病(Bipolariscynodontis)、弯孢霉叶枯病(Curvularialunata)、锈病(Pucciniazoysiae)、德氏霉叶枯病(Drechsleraspp.)、喙孢霉云纹病(Rhynchosporiumsecalis)、黑孢霉叶斑病(Nigrosporasphaeri)、梨孢灰斑病(Pyriculariagrisea)和炭疽病(Colletotrichumgraminicola)共10种病害。翁启勇等[9]发现福建省的结缕草锈病发生比较普遍。国外方面，Smiley 等[10]详细介绍了世界范围内的草坪草病害，其中记录的结缕草病害与翁启勇整理的病害种类基本一致。

细叶结缕草(Zoysiatenuifolia)又名天鹅绒草，台湾草，是结缕草属禾本科草坪草种。其草茎叶纤细美观，形成的草坪低矮平整，再加上侵占力极强，能在铺设草皮后较短时间内快速成坪[11]。所以该暖季型草坪草种被普遍应用于我国华南地区的公园，住宅小区和庭院等区域供人观赏。又因其抗逆性和耐践踏能力强，故也可做运动和各种娱乐休闲活动的场地。

对海南和广东省多个地区的细叶结缕草草坪草病害进行调查，发现一种病害对细叶结缕草危害严重，染病草坪上常出现圆形如眼圈状或者不规则形状的褐色枯草斑，直径为1～2 m，有些大型病斑可达3 m。由于该病害分布较广，并极大的影响了细叶结缕草草坪的应用和观赏价值，因此，急需明确该病害的病原及探索合理化学防治方法，通过对草坪草染病草坪病原菌进行分离、鉴定，并在室内测定了杀菌剂对病原菌的毒力，以期科学鉴定与有效防治该草坪草病害。

1 材料和方法

1.1 病害调查与标本采集

2014～2016年，对我国海南省海口市、三亚市、万宁市、琼海市、文昌市和广东省广州市、深圳市、湛江市8个城市中15处由细叶结缕草建植的草坪绿地进行了病害调查。在调查过程中，各地均发现了症状相似的细叶结缕草病害，记录发病症状后，用像机拍摄田间危害症状，每个区域均采发病叶片装入保鲜袋，同时记录采集地点后，带回实验室保存于4℃冰箱内备用。

1.2 病原菌的分离

选择发病症状明显的叶片，用无菌水冲洗干净后，采用常规植物病理组织分离法，在病斑与健康叶片处剪下5 mm2的小块组织，放入2%的次氯酸钠溶液中消毒1 min，接着用无菌水冲洗3次，置于超净工作台中晾干后放入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 培养基上，常温下培养。待菌丝从叶片边缘长出后，用接种针切取2～3 mm 菌丝段于新的含有PDA的培养皿中进行纯化培养。病原菌纯化后，将其保存于PDA斜面培养基试管中，并放置于4℃冰箱内备用。随机选取分离自海南省海口市病原菌菌株HD-RS1用于进一步研究。

1.3 病原菌的形态鉴定

将分离获得的病原菌菌株HD-RS1活化培养后，持续观察其菌落形态并拍照。在微生物显微镜下观察病原菌的菌丝形态特征，记录其微观形态特征，并拍摄照片，测量其大小，测量50次。查阅相关专著文献进行鉴定。

1.4 病原菌分子鉴定

将菌株HD-RS1在PDA培养基上活化后于25℃培养箱培养1周，用无菌玻璃薄片将菌丝刮下，并置于液氮中充分研磨。参照van Burik等[12]的CTAB法对病原菌基因组DNA进行提取，并将提取的DNA保存于-20℃冰箱内。利用White等[13]设计的rDNA-ITS区域通用引物ITS-1和ITS-4 (上海英骏生物技术有限公司合成)，以病原菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，预期产物约700 bp。PCR扩增体系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL(Takara，大连，中国)，20 μmol/L引物各1 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34个循环；72℃延伸10 min。将所得PCR产物加入琼脂糖中电泳，并在凝胶成像仪上检测。PCR产物委托上海生工生物工程有限公司对PCR产物进行存化并测序。将测得的ITS序列提交至NCBI核酸数据库中获得GenBank登录号，同时用数据库中的Blastn软件进行比对和同源性分析，并下载相似度高的Rhizoctonia属中同为草坪草病原菌相关序列。利用Mega 7.0中的Clustal X功能对序列进行比对，然后采用邻接法(Neighbor-joining method，NJ)构建系统发育树，树中节点的自举置信度水平由自展值( Bootstrap value) 估计，重复次数为1 000。最后将分析结果结合形态学特征对病原菌进行鉴定。

1.5 致病性测定

将田间土壤和细沙按1∶1体积混匀灭菌后，分装在10 cm×10 cm塑料花盆中，将细叶结缕草种子(购于北京克劳沃集团) 按密度为0.5 mg/cm2播种于土壤中，播深为1 cm，每天浇无菌水50 mL以确保土壤湿润。播种后，每盆施用0.5 g颗粒肥(海丰，安徽，中国)，播种1周，种子开始萌发并出苗，3周后进行修剪，每个星期修剪一次，保留草坪草高度约5 cm，在温室中培养6周后备用。将菌株HD-RS1在新的PDA培养基上培养5 d后，用灭菌后的打孔器在菌落边缘处打取直径约为5 mm的菌丝块，将长有菌丝的一面盖于植株叶片上，每盆栽接种10个菌块，以接种无菌PDA菌饼作为对照。每个处理接种5盆细叶结缕草，作为5个重复。接种后，盆栽套袋保湿48 h，将其放入光照培养箱内，持续观察发病情况一周。

1.6 杀菌剂对病原菌室内毒力测定

供试杀菌剂为田间常用于防治草坪草病害的9种杀菌剂，分别为1)70%代森锰锌可湿性粉剂，四川国光农化有限公司；2)70%甲基托布津可湿性粉剂，江苏龙灯化学有限公司；3)75%百菌清可湿性粉剂，利民化工股份有限公司；4)50%多菌灵可湿性粉剂，四川国光农化有限公司；5)20%三唑酮乳油，四川国光农化有限公司；6)43%戊唑醇悬浮剂，拜耳作物科学(中国)有限公司；7)12.5%腈菌唑乳油，华北制药集团爱诺制药有限公司；8)50%异菌脲悬浮剂，拜耳作物科学(中国)有限公司；9)12.5%烯唑醇可湿性粉剂，上海爱帮农科技有限责任公司。

采用菌丝生长速率法测定杀菌剂对病原菌的毒力大小。在培养了4 d的生长状况良好的菌落边缘打取菌饼并移至预先配制好的浓度为0、0.1、1.0 10.0和100.0 mg/L的各杀菌剂的PDA培养基上，在25℃的培养箱中培养4 d后观察菌落生长情况，然后测量菌落直径，计算相对抑菌率。根据菌株在不同浓度杀菌剂的抑菌率大小，设置各杀菌剂的浓度梯度用于毒力的测定，每种杀菌剂均设5个浓度梯度(表2)，每皿为1个重复，每个浓度4个重复，置于25℃的培养箱中培养4 d后测量菌落直径，计算各菌落的净生长量和相对抑菌率，并对杀菌剂浓度的对数值(x)和相对抑菌率的概率值(y)进行拟合，得出拟合方程，计算得到相关系数和EC50值。

净生长量(mm)=菌落直径(mm)-菌饼直径(mm)

相对抑制率=[(对照净生长量-处理净生长量)/对照净生长量]×100%

表1 杀菌剂的毒力测定浓度梯度

2 结果与分析

2.1 细叶结缕草褐斑病症状

在调查的海南省和广东省8个城市的15处草坪绿地中均发现褐色斑为害细叶结缕草，且危害严重。其发病的典型特征是草坪呈现出褐色的大型枯草斑或形成蛙眼状环形病斑或不规则形状的大块斑块(图1A,B)。染病单个植株通常被蛛丝状菌丝缠绕，叶片首先呈现水浸状斑点，然后斑点逐步扩大形成条形或梭行的病斑，病斑边缘有明显深褐色边界，接着叶片变成灰白色，最终整个植株枯萎死亡(图1C,D)。当病害严重时，病害可迅速蔓延，枯萎植株形成可达2～3 m的枯草斑，有时枯草斑圈内植株逐渐恢复，而病原菌仍逐步向外扩张，因此，形成了蛙眼状枯草斑。

图1 细叶结缕草褐斑病症状Fig.1 The symptoms of brown patch on Zoysia tenuifolia

2.2 病原菌培养性状和形态学特征

从15个细叶结缕草褐斑病病害叶片样品中共分离获得15株病原菌，经观察发现各个病原菌的培养性状和形态学特征一致，随机选取分离自海南省海口市的病原菌菌株HD-RS1用于进一步分析。病原菌在PDA培养基上生长迅速，首先菌丝稀薄快速向外扩延，2～3 d即可长满全皿(90 mm)，菌丝灰白色至淡褐色，接着菌丝逐渐变厚，形成蓬松的气生菌丝。培养一周后菌丝集结，菌落开始变得致密，部分气生菌丝开始塌陷。随着培养时间的增加，菌落表面逐渐由灰白色变为褐色，菌丝开始集结形成致密的深褐色菌核。随着菌丝不断集结，整个皿可形成一圈菌核(图2A,B)。

图2 立枯丝核菌在PDA上的培养性状 (A 正面，B 反面)Fig.2 Colony morphology of Rhizoctonia solanion the PDA(A right，B reverse)

将菌丝放置于生物显微镜下观察，可见菌丝粗壮，直径7～12 μm，直角分枝，分枝处缢缩，附近形成隔膜。初生菌丝较细，老熟后常形成粗壮的念珠状菌丝(图3A,B)。

2.3 分子生物学鉴定

对病原菌菌株的rDNA-ITS序列进行扩增后，将PCR产物纯化后测序，获得了710 bp的rDNA-ITS序列片段，与预期片段大小相符。将病原菌序列提交至NCBI网站获得序列登录号为：KR815446。利用NC BI网站中的BLAST软件，对所测菌株的序列进行同源性比对得知该菌株病原菌与立枯丝核R.solani(登录号KU696484和KT362082) 的同源性均达到了100%。从构建的系统发育树可以看出，分离自海南省海口市的病原菌菌株HD-RS1与多R.solani菌株聚在一个分类单元，且其他的Rhizoctonia属真菌菌株处在不同分支,自举置信度高达100%(图4)。

图3 立枯丝核菌菌丝形态Fig.3 Mycelial morphology of Rhizoctonia solani

图4 于细叶结缕草褐斑病病原菌菌株rDNA-ITS与相关真菌的系列比较而构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic relationships amongisolates of the pathogen of brown patchand related fungi of internal transcribed space(ITS)rDNA sequence

2.4 病原菌的致病性测定

将病原菌菌株HD-RS1接种细叶结缕草植株3 d后，叶片开始发病，发病初期病斑为浅黄色或淡绿色小斑点，后逐步扩散为长椭圆形或梭行病斑，病斑周围为黄褐色，接种5 d后，叶片大部分面积变褐枯黄，形成深褐色条状病斑，叶片伴有萎蔫症状，可见褐色气生菌丝覆盖于叶片之上。接种7 d后，接种叶片均出现病症，发病严重的叶片呈现枯萎状。接种病原菌植株表现的症状与田间发病症状一致，并且可从病斑组织重新分离病原菌，完成科赫法则的验证。

2.5 杀菌剂对病原菌的毒力

应用生长速率测定法在PDA平板上测定9种杀菌剂对R.solani菌丝生长的抑制作用，结果表明，在供试的9种药剂中5%烯唑醇、43%戊唑醇、20%三唑酮和12.5%腈菌唑对R.solani的毒力较高，其EC50值分别为0.055、0.113、0.175和0.195 mg/L，其次是70%代森锰锌和50%异菌脲，其EC50值为0.634和0.640 mg/L，毒力较低的是75%百菌清、50%多菌灵和70%甲基托布津，其EC50值分别为1.671，3.632和7.021 mg/L(表2)。

表2 9种杀菌剂对立枯丝核菌的毒力

3 讨论

对海南和广东省主要草坪建植草种之一的细叶结缕草病害进行调查，发现了草坪褐斑病病害可严重危害两省多处细叶结缕草草地。通过观察病害的田间为害症状、病原菌形态、培养性状、分子生物学特性和致病性测定并查阅相关文献资料[15-18]确定了导致细叶结缕草病害的病原为立枯丝核菌(R.solani)。该病害对华南地区细叶结缕草病害造成了较大危害，当地草坪管理者应引起足够的重视，做好相应的预防措施。

草坪褐斑病病原菌除立枯丝核菌(R.solani)以外，禾谷丝核菌(R.cerealis)，玉米丝核菌(R.zeae)和水稻丝核菌(R.oryzae)也可引起此病[1,10]。而此次研究分离获得病原菌经鉴定均为R.solani，说明我国华南地区褐斑病病原主要群体为R.solani。我国已有科技人员对华南地区草坪草病害进行调查，翁启勇等[9]报道了Rhizoctonia属真菌可危害细叶结缕草，刘晓妹等[8]认为R.solani可危害高尔夫球场果岭狗牙根(Cynodondactylon)。然而，由R.solani导致细叶结缕草单个草种的褐斑病在我国鲜见报道。而且，笔者同时结合了病原菌形态特征和分子生物学特征对病原菌进行鉴定，准确确诊了细叶结缕草褐斑病病原菌为R.solani。

立枯丝核菌褐斑病是分布于世界范围内的重要草坪草病害，它可侵染包括早熟禾(Poaspp.)、高羊茅(Festucaspp.)、黑麦草(Loliumspp.)、狗牙根(Cynodonspp.)、结缕草(Zoysiaspp.)在内的多种草坪草[15,18]。该病害主要危害叶片、叶鞘和茎秆等部分，可引起苗腐、叶枯和茎基腐等严重症状。草坪褐斑病危害暖季型草坪草可形成较大的褐色枯草圈，因此，又叫做大斑病(large patch)[10]。试验观察到的褐斑病危害细叶结缕草形成的枯草斑可达3 m的大斑。由于枯草斑中心边缘病株恢复较快，导致草坪呈现环状蛙眼状，即中央绿色，边缘枯黄的环带，在清晨露水较多或高湿时，病株可见菌丝缠绕，整个草坪呈现一副衰败的景象。此次研究所观察到的症状与褐斑病典型的症状相似，这些症状都将有助于该病害的鉴定。

化学防治是防治草坪草真菌病害最有效的方法，在使用化学杀菌剂过程中应根据病害不同种类及特点选用防效较好的药剂，减少化学药剂的使用，从而降低对环境的污染。应用生长速率测定法测定了9种杀菌剂对R.solani的毒力试验，结果表明，在供试的9种药剂中5%烯唑醇、43%戊唑醇、20%三唑酮和12.5%腈菌唑4种14-α-脱甲基反应抑制剂类杀菌剂抑菌效果最好，其EC50在0.055～0.195 mg/L，李增平等[19]和杨继堂等[20]室内测定了多种杀菌剂对R.solani的毒力，结果同样表明DMIs杀菌剂抑菌效果较好。DMIs类杀菌剂是19世纪60、70年代开发的一类广谱、高效的内吸型杀菌剂，对R.solani的防治效果显著。而R.solani对50%多菌灵和70%甲基托布津2种苯并咪唑类(Methyl Benzimidazole Carbamates，MBCs)类杀菌剂敏感性较低。表明田间菌株已对MBCs类杀菌剂产生了一定抗药性。因此，在采用化学方法防治草坪草褐斑病时，应避免长期大量使用同一种类型的杀菌剂，降低病原菌产生抗药性的风险。

草坪草褐斑病是流行性很强的病害，早期只要有少许植株染病，不及时防治，病害很可能就会迅速扩展，造成大片植株死亡，形成枯草斑[10]。因此，对于该病害的防治，首先需做好预测预报工作，在病害发生的早期就应该对其进行准确的鉴定，提早做出预防方案[21]。除此之外，在建植草坪之前应尽量选用抗病品种或采用多品种混播草坪[22]。尽量采取生物防治方法[23]，合理施肥、科学灌溉、改善草坪及土壤通气透水条件，及时清理枯草层较少病残体和菌源也可起到一定的防治效果。同时适量配合杀菌剂可对褐斑病起到较好的防效[24-27]。

4 结论

通过对病害田间为害症状，病原菌培养性状、形态学特征及致病性进行测定并结合病原菌分子生物学特征(rDNA-ITS序列)分析，将引起细叶结缕草褐斑病病原菌鉴定为R.solani，同时室内测定9种杀菌剂对病原菌毒力的结果表明，5%烯唑醇对R.solani毒力最强，其EC50值为0.055 mg/L；毒力最低的为70%甲基托布津，其EC50值为7.021 mg/L。在供测杀菌剂中DMIs类杀菌剂对R.solani抑菌效果最好。