植物乳杆菌LPL-1产细菌素发酵培养基优化

王 瑶 李 琪 李平兰

(1.中国农业大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心， 北京 100083；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 100083)

0 引言

乳酸细菌素是乳酸菌在转录翻译过程中通过核糖体机制合成，并分泌到菌体体外的一类具有抑菌活性的蛋白质，细菌素具有无抗药性、无毒副作用及易被人体降解的特点，因此不仅是一种天然的食品防腐保鲜剂[1-2]，而且具有取代抗生素的潜力[3]。目前已经报道了许多新的细菌素及产生菌(如植物乳杆菌LPL-1的植物乳杆菌素LPL-1[4]、动物双歧杆菌B04的bifidocin A[5]与类植物乳杆菌L-ZS9的paraplantaricin L-ZB1[6]等)，但其细菌素的产量严重制约了其工业化生产及应用。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是食品发酵工业中常见的益生菌，已经被广泛应用于奶制品、肉制品及果蔬发酵食品中[7-9]。产细菌素的植物乳杆菌不仅具有益生特性，而且具有抑菌特性，因此在食品发酵与食品防腐保鲜领域具有应用潜力。

植物乳杆菌LPL-1(LactobacillusplantarumLPL-1)不仅是一株新的菌种，而且所产细菌素为新的IIa类细菌素，有作为天然食品生物防腐剂的巨大应用潜力[4]，然而菌体自身所产细菌素的产量比较低，其合成不仅受到自身诱导肽的调控，而且与培养基的组成及培养条件有关[10]。本文以植物乳杆菌LPL-1为研究对象，通过单因素试验、Plackett-Burman试验及响应面法优化植物乳杆菌素LPL-1的培养基组分，获得该菌种产生细菌素的最佳培养基组成，为该菌种产业化生产细菌素提供一定的实践基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基及试剂

植物乳杆菌LPL-1分离自发酵鱼，指示菌单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 54002由实验室保存。MRS培养基(葡萄糖质量分数2%、酵母粉质量分数0.4%、蛋白胨质量分数1%、牛肉膏质量分数1%、吐温-80体积比1 mL/L、磷酸氢二钾质量浓度2 g/L、乙酸钠质量分数0.5%、硫酸镁质量浓度0.2 g/L、硫酸锰质量浓度0.1 g/L、柠檬酸氢二铵质量浓度2 g/L、蒸馏水体积1 L)各组成成分购自西陇科学股份有限公司。

1.2 细菌素提取

按照1%接种量将植物乳杆菌LPL-1接种至100 mL MRS培养基，37℃静止培养24 h，8 000 r/min离心15 min收集上清液，按照培养基与-20℃预冷丙酮体积比1∶3进行配比，-20℃放置1 h取出，8 000 r/min离心15 min收集沉淀，后用-20℃预冷的丙酮等体积洗涤脱水，8 000 r/min离心15 min收集沉淀，沉淀室温(20℃)干燥用于计算酶活力。

1.3 抑菌活性的检测

采用牛津杯双层平板扩散法测定细菌素的酶活性[11]。将提取的细菌素进行2倍稀释，取样100 μL进行抑菌试验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为1个活力单位，其倒数即是原液的细菌素相对抑菌效价，单位为AU/mL。

相对抑菌效价标准曲线的制作：将已知相对抑菌效价的细菌素稀释为80%、60%、40%与20%，分别取100 μL进行抑菌试验，以对应抑菌圈直径为横坐标，相对抑菌效价对数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4 单因素试验

选择不同碳源、氮源、刺激因子、磷酸盐缓冲液及二价离子作为影响抑菌活性的主要因素，通过单因素试验选择Plackett-Burman(PB)试验的影响因素与水平。

1.4.1碳源

分别采用2%的葡萄糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉及麦芽糖作为MRS培养基碳源成分，培养温度37℃，培养时间24 h。发酵结束后按照1.2节与1.3节中方法进行细菌素的提取与活性验证。

1.4.2氮源

分别采用1%的酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨及硝酸钠作为MRS培养基氮源成分，培养温度37℃，培养时间24 h。发酵结束后按照1.2节与1.3节中方法进行细菌素的提取与活性验证。

1.4.3刺激因子

分别采用1 mL/L 的吐温(Tween)-20、吐温-60、吐温-80、聚乙二醇(PEG)-1000、PEG-4000与PEG-8000作为MRS培养基刺激因子，培养温度37℃，培养时间24 h。发酵结束后按照1.2节与1.3节中方法进行细菌素的提取与活性验证。

1.4.4缓冲液

分别采用2 g/L的K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4与NaH2PO4作为MRS培养基缓冲成分，培养温度37℃，培养时间24 h。发酵结束后按照1.2节与1.3节中方法进行细菌素的提取与活性验证。

1.4.5二价离子

分别采用0.2 g/L的MgSO4、MnSO4、ZnSO4、FeSO4与CuSO4作为MRS培养基缓冲成分，培养温度37℃，培养时间24 h。发酵结束后按照1.2节与1.3节中方法进行细菌素的提取与活性验证。

1.5 Plackett-Burman试验

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 10.0设计Plackett-Burman试验(N=12)。具体设计及相应区间如表1所示，根据各因素的贡献率与P值确定主要影响因素。

表1 Plackett-Burman试验设计Tab.1 Design of Plackett-Burman experiment

1.6 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验分析的显著性、贡献率及效应值设计试验的方向与步长。最陡爬坡试验具体设计方案如表2所示。

表2 最陡爬坡试验设计Tab.2 Design of the steepest grade test

1.7 Box-Behnken响应面试验

由最陡爬坡试验的拐点确定响应面试验的中心点及相应区间，采用Design-Expert 10.0软件设计试验方案，优化葡萄糖、酵母粉质量分数与吐温-80体积比，以相对抑菌效价为响应值进行17组试验，具体设计方案如表3所示。模型对酶活力进行二次多元回归拟合，生成等高线图与响应面曲线图，获得最佳发酵参数，对模型进行方差分析，确定其可信度。

表3 Box-Behnken试验设计Tab.3 Design of Box-Behnken experiment

1.8 模型的验证

利用响应面模型优化的最佳条件进行发酵试验，比较模型预测值与试验值，验证模型的有效性。

1.9 数据处理与分析

每个试验重复3次，取平均值。采用SPSS 23.0进行单因素方差分析与显著性差异分析，Design-Expert 10.0进行Plackett-Burman与Box-Behnken试验设计。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1碳源

碳源是菌体代谢与生长的主要元素，不同碳源对植物乳杆菌LPL-1产植物乳杆菌素LPL-1的影响如图1所示(图中不同字母表示差异显著，下同)。Lb.plantarumLPL-1可以利用多种碳源，方差结果显示不同种类的碳源对细菌素的活性具有显著性影响(P<0.05)。以葡萄糖为碳源时，所获得细菌素相对抑菌效价达到286.67 AU/mL，明显高于其它碳源。由于不同碳源的结构不同，Lb.plantarumLPL-1对蔗糖、半乳糖、乳糖、淀粉与麦芽糖利用率比较低，因此确定葡萄糖为Lb.plantarumLPL-1产植物乳杆菌素LPL-1的最佳碳源。

图1 碳源对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.1 Influence of carbon source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

不同类型乳酸菌利用碳源的差异性比较大，如戊糖乳杆菌31-1[12]、植物乳杆菌ST23LD[13]与酸乳片球菌C20[14]的最佳碳源分别为乳糖、山梨醇与麦芽糖。本文的最优碳源是葡萄糖，导致菌体利用不同碳源的原因可能是菌体来源、所处的生长环境及内部代谢途径的不同。

2.1.2氮源

氮源是微生物合成的主要因素，可以分为有机氮源与无机氮源。有机氮源被微生物酶解为小分子物质，被菌体吸收转化后进一步合成代谢，最终形成菌体所必需的营养物质；无机氮源不仅可以调节外部环境的pH值，而且可以参与菌体的代谢，但是其利用速率比较快[15]。本文利用有机氮源与无机氮源不同组合，测定菌体产乳杆菌素 LPL-1的活性，结果如图2所示，有机氮源比无机氮源更能促进乳杆菌素LPL-1的产生，有机氮源降解的营养成分有可能促进了细菌素合成蛋白的表达。方差结果显示，酵母粉与胰蛋白胨更能促进细菌素的合成，但是两者之间差异不显著，复合氮源的使用可以更大提高细菌素的活性，因此采用不同氮源比例(胰蛋白胨与酵母粉质量比)1∶1、1∶2、2∶1进行复配，结果如图3所示。

图2 氮源对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.2 Influence of nitrogen source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

图3 氮源质量比对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.3 Influence of nitrogen ratio on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

由图3可知，氮源比例为2∶1时，乳杆菌素LPL-1相对抑菌效价最高，因此，确定最优氮源比例为2∶1，并以此为基础进行Plackett-Burman与响应面试验。

2.1.3刺激因子

刺激因子主要是表面活性剂类的物质，它可以影响细胞膜的通透性[16]，进而影响细菌素的合成与分泌，不同种类的刺激因子对乳杆菌素LPL-1的影响如图4所示，不同刺激因子对细菌素的产生差异性明显(P<0.05)，吐温-80为刺激因子时，细菌素的相对抑菌效价达到310.83 AU/mL，明显高于其它刺激因子(P<0.05)，因此确定吐温-80为最佳刺激因子。

图4 刺激因子对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.4 Influence of surfactants on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

GARVER等[17]初步证实了吐温-80对细菌素影响的重要性；庄绪亮等[18]研究了吐温-80对Nisin产生的影响，确定了吐温-80对细菌的产生具有刺激作用；本文同样初步证明了吐温-80对植物乳杆菌素活性的影响。

2.1.4二价离子

二价离子通常作为酶反应活性中心的辅基，对菌体蛋白质的转录翻译具有重要影响[19]，不同种类的二价离子对细菌素活性的影响如图5所示，不同离子对细菌素的产生差异性明显(P<0.05)，硫酸镁与硫酸锰对细菌素活性影响明显，因此确定其为最佳影响因子。

图5 二价离子对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.5 Influence of divalentions on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

2.1.5缓冲液

在培养基体系中，缓冲液主要起到稳定pH值作用[20]，促进菌体生长，同时磷又是菌体内糖类、蛋白质与能量等主要营养物质的组成元素，因此本文分析了不同缓冲体系对细菌素活性的影响，结果如图6所示，磷酸氢二钾为细菌素发酵最佳缓冲液，方差分析结果显示，缓冲液之间对该细菌素的活性影响差异并不显著(P>0.05)，在后期的Plackett-Burman试验中，选择磷酸氢二钾作为考察因素进行重复验证。

图6 缓冲液对植物乳杆菌LPL-1产乳杆菌素LPL-1的影响Fig.6 Influence of buffer on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

2.2 Plackett-Burman试验

以单因素试验为基础，根据Plackett-Burman试验的贡献率与显著性确定主要影响因素，为后续的Box-Behnken响应面试验奠定基础。以葡萄糖质量分数(A)、酵母粉质量分数(B)、吐温-80体积比(C)、硫酸锰质量浓度(D)、硫酸镁质量浓度(E)与磷酸氢二钾质量浓度(F)为考察因素(A～F为编码值)，设置-1与1的不同水平(表4、5)，以相对抑菌效价为响应值(表4)，利用Design-Expert 10.0进行设计与分析，结果如表4与表5所示。根据Design-Expert 10.0数据分析，模型方差P<0.05，说明数据模型具有可信度，葡萄糖质量分数(A)、酵母粉质量分数(B)与吐温-80体积比(C)贡献率最高，并且具有显著性差异，因此，选择以上3个因素进行最陡爬坡试验确定中心点，同时磷酸氢二钾质量浓度为正效应，硫酸镁质量浓度为负效应，硫酸锰质量浓度为正效应，因此，选择磷酸氢二钾质量浓度3 g/L，硫酸镁质量浓度0.2 g/L、硫酸锰质量浓度0.3 g/L，其余因素按照培养基初始比例进行添加，牛肉膏质量分数1%、乙酸钠质量分数0.5%、柠檬酸氢二铵质量浓度2 g/L。

表4 Plackett-Burman试验结果Tab.4 Results of Plackett-Burman experiment

表5 Plackett-Burman试验效应分析Tab.5 Effect analysis of Plackett-Burman experiment

2.3 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验结果设计主要因素的最陡爬坡试验，葡萄糖质量分数、酵母粉质量分数、吐温-80体积比为显著因素。根据这3个因素的取值高低水平、效应值，以细菌素相对抑菌效价为响应值，设定这3个因素的变化方向及步长。最陡爬坡试验结果呈现先增高后降低的趋势，在3号试验点(表2)处出现最高点，该点处葡萄糖质量分数为2%、酵母粉质量分数为0.5%、吐温-80体积比为1 mL/L，此时植物乳杆菌LPL-1产细菌素相对抑菌效价达到最大，最大值为583.23 AU/mL。该点即为下一步Box-Behnken试验设计的中心点。

2.4 Box-Behnken响应面试验

利用Design-Expert 10.0软件对葡萄糖质量分数、酵母粉质量分数、吐温-80体积比设计三因素三水平的Box-Behnken试验，试验结果见表6。对Box-Behnken试验结果进行方差分析，由表7可知，所选择的回归模型的P值小于0.05，表明整体模型对试验结果具有显著的影响，具有可信度；而失拟项的P值为0.299，大于0.05，失拟项检验不显著，说明未知因素对试验结果的影响较小，残差主要由随机误差引起，模型选择适当；该模型的相关系数R=0.983 8，校正相关系数0.963 0，信噪比大于4，表明模型可信度很高。细菌素相对抑菌效价Y对葡萄糖质量分数、酵母粉质量分数和吐温-80体积比的多元二次回归方程为

表6 Box-Behnken试验结果Tab.6 Results of Box-Behnken experiment

Y=784.458+89.629 2A+24.669 4B+30.500 6C-25.151 7AB-0.153 076AC+21.458BC-274.751A2-223.076B2-326.02C2

注：** 表示P<0.01。

图7 Box-Behnken试验的响应面三维图和等高线图Fig.7 Response surface three-dimensional diagrams and counter maps of Box-Behnken experiments

2.5 响应面立体分析及等高线图

由回归方程所做的响应面立体图与等高线图如图7所示，主要反映了葡萄糖、酵母粉与吐温-80之间的相互作用，通过方程可知，二次项系数为负值，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 10.0分析计算，最适发酵培养基为葡萄糖质量分数2.08%、酵母粉质量分数0.51%与吐温-80体积比1.02 mL/L，由于胰蛋白胨与酵母粉的最优质量比为2∶1，因此胰蛋白胨质量分数确定为1.02%，此时最大相对抑菌效价为793.21 AU/mL。

2.6 回归模型的验证

为了验证回归方程的准确性，利用优化后培养基的条件(葡萄糖质量分数2.08%、酵母粉质量分数0.51%、胰蛋白胨质量分数1.02%、牛肉膏质量分数1%、吐温-80体积比1.02 mL/L、磷酸氢二钾质量浓度3 g/L、乙酸钠质量分数0.5%、硫酸镁质量浓度0.2 g/L、硫酸锰质量浓度0.3 g/L、柠檬酸氢二铵质量浓度2 g/L、蒸馏水体积1 L)进行3次重复性验证，细菌素的平均相对抑菌效价为(752.11±4.98) AU/mL，与预测值的拟合率达到94.7%，表明预测值与实际值具有良好的拟合性，优化后培养基可用，同时优化后细菌素相对抑菌效价(752.11 AU/mL)比优化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍，说明本试验优化的培养基明显提高了细菌素的产量。

3 结束语

在单因素试验基础上，利用Plackett-Burman试验确定了主要影响因素为葡萄糖质量分数、酵母粉质量分数与吐温-80体积比，最陡爬坡试验确定了中心点，响应面Box-Behnken试验建立了二次多项式回归模型，最终确定发酵培养基为：葡萄糖质量分数2.08%、酵母粉质量分数0.51%、胰蛋白胨质量分数1.02%、牛肉膏质量分数1%、吐温-80体积比1.02 mL/L、磷酸氢二钾质量浓度3 g/L、乙酸钠质量分数0.5%、硫酸镁质量浓度0.2 g/L、硫酸锰质量浓度0.3 g/L、柠檬酸氢二铵质量浓度2 g/L、蒸馏水体积1 L。在此条件下细菌素相对抑菌效价(752.11 AU/mL)比优化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍。