秸秆湿贮存过程添加剂协同调控对甲烷产量的影响

2018-09-17郭建斌温啸宇庞昌乐董仁杰

农业机械学报 2018年9期

崔宪郭建斌徐艳温啸宇庞昌乐董仁杰，2

(1.中国农业大学工学院，北京 100083； 2.中国农业大学烟台研究院，烟台 264670)

0 引言

玉米秸秆是我国主要农业废弃物之一，据统计，2015年其产量达2.65亿t[1]。作为一种可再生生物质资源，秸秆可作为多种生物质能源(如沼气、氢气及生物乙醇等)生产的原料[2]。由于秸秆的生产具有季节性，有效贮存是保证规模化沼气工程全年稳定运行的前提。湿贮存技术较干贮存具有干物质损失低和可降低火灾危害等优点，在欧洲被广泛应用于沼气工程的原料贮存环节[3]，经过湿贮存的玉米秸秆产甲烷潜力可提高3%～15%[4-5]。然而在我国秸秆优先用于肥料化、饲料化[6]，用于沼气工程的秸秆风干程度不一，理化性质迥异，尤其当原料可溶性糖不足时，会严重影响玉米秸秆的贮存品质[7]。研究表明原料至少含3%的可溶性糖才能获得优质贮存料[7]，所以调控干黄秸秆贮存过程是发展秸秆沼气工程的重要技术环节。目前，国内外主要通过补充添加剂来改善秸秆贮存品质，如营养强化剂(葡萄糖、蔗糖)[8-9]、发酵促进剂(乳酸菌、纤维素酶)[10-11]和发酵抑制剂(甲酸、乙酸)[12-13]。研究内容主要集中在青贮饲料生产领域，而关于干黄玉米秸秆沼气工程贮存领域研究较少。

本文以干黄玉米秸秆为原料，通过添加葡萄糖及其与同型乳酸菌(植物乳杆菌)、异型乳酸菌(短乳杆菌)和乙酸协同调控贮存过程，系统分析不同添加剂对原料贮存品质、细菌多样性以及产甲烷潜力的影响，为沼气工程秸秆原料的高效贮存提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验原料与菌剂

玉米秸秆于2016年10月取自河南省巩义市，品种为丰玉2号，为鲜食玉米品种。收获后玉米秸秆含水率较高，呈青色，在自然条件下风干20 d左右后呈干黄色，粉碎至1～3 cm的长度后运送至实验室进行后续试验。试验所用的干黄玉米秸秆理化性质见表1。

表1 干黄玉米秸秆与接种污泥的化学组成性质Tab.1 Chemical composition of corn stover and inoculated sludge

原料产气潜力测试的接种污泥取自北京城市污水处理厂，过10目筛除去沙粒，置于37℃的恒温水浴锅中，保持污泥活性，接种污泥的性质见表1。

同型乳酸菌(植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum))与异型乳酸菌(短乳杆菌(Lactobacillusbrevis))均购自于日本生物资源中心(NBRC)，菌株编号分别为15891与107147。MRS培养基(青岛海博生物公司)用于菌种活化，MRS琼脂培养基(青岛海博生物公司)用于活菌计数。

1.2 湿贮存原料调制与试验设计

将添加剂溶于一定量水中，均匀喷洒至准确称取的50 g干黄玉米秸秆上，调整体系含水率至65%。将调制好的各组秸秆分装至聚乙烯袋中(尺寸：250 mm×300 mm)，用真空包装机抽真空并热封处理后，放置于人工气候箱(温度28℃，无光照，相对湿度65%)湿贮存30 d，分别选取第0、3、7、15、30天时动态分析化学组分与发酵品质。

共设计5个试验组进行湿贮存：空白组(Con组)，无添加剂的干黄玉米秸秆；单一葡萄糖组(Glu组)，葡萄糖添加量为原料(含水率65%)的3%；葡萄糖植物乳杆菌协同组(LP组)，葡萄糖添加量为原料(含水率65%)的3%，植物乳杆菌接种量为原料干基的1×106CFU/g；葡萄糖短乳杆菌协同组(LB组)，葡萄糖添加量为原料(含水率65%)的3%，短乳杆菌接种量为1×106CFU/g(以原料干基计)；葡萄糖乙酸协同组(AA组)，葡萄糖和乙酸添加量分别为原料(含水率65%)的3%和0.4%。

1.3 细菌多样性研究

在无菌环境下，准备空白组贮存0 d (Con 0)与30 d (Con 30) 样品以及其余4组湿贮存30 d样品(Glu 30、LP 30、LB 30、AA 30)各10 g，与90 mL无菌生理盐水混合，37℃恒温振荡2 h得到微生物菌悬液，用孔径0.22 μm无菌滤膜过滤得到微生物菌体。用灭菌手术剪剪碎，将整张带有菌体的滤膜置于2 mL无菌离心管中，使用E.Z.N.A土壤DNA提取试剂盒进行微生物DNA提取，检测合格后送至上海美吉生物科技有限公司进行Illumina Miseq测序。

PCR扩增选择扩增区域为16S rDNA V4-V5，所用引物为338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。根据Illumina MiSeq测序平台的标准流程进行双端(2×300 bp)测序，得到2×300 bp的数据。数据预处理后进行生物信息学分析、多样性分析和物种组成分析。

1.4 厌氧消化试验设计

厌氧消化试验分别选取5个试验组湿贮存30 d的样品，共计5组进行试验。设计仅接种污泥处理组，用于计算污泥产气量和秸秆产气净产量。

该批次厌氧发酵试验于带有一次性铝盖的120 mL玻璃发酵瓶中进行。污泥与玉米秸秆的添加量(基于挥发性固体质量)之比为2∶1，将污泥与秸秆加入发酵瓶中，充分混匀后，充入氮气，随后立即盖好硅胶塞，标号后置于37℃恒温水浴锅中。试验期间使用玻璃注射器测量日均产气量，并分析计算累积产气量。产气潜能用修正的Gompertz模型进行拟合[5]，公式为

式中p——扣除空白的t时刻的单位挥发性固体累积气体产量，mL/g

p0——单位挥发性固体最大产能潜能，mL/g

Rmax——单位挥发性固体最大产甲烷速率，mL/(g·d)

λ——迟滞期，d

t——试验持续时间，d

1.5 分析方法

总固体含量测定采用105℃干燥恒重法、挥发性固体含量测定采用550℃灼烧恒重法。原料湿贮存后会产生大量有机酸，在105℃条件下进行总固体含量测定时有机酸挥发会引起测定结果偏低。因而，本文根据KREUGER等[14]报道的湿贮存原料在100℃下干燥时不同有机酸的挥发系数进行修正。pH值使用Orin 5-Star 型pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)测定。半纤维素、纤维素、木质素含量采用Van Soest Fiber分析方法，使用ANKOM A200型纤维分析仪(USA)进行测定。沼气成分(CH4和CO2)由SP-2100型气相色谱仪(北瑞利分析仪器有限公司，中国)测出，挥发性脂肪酸与乙醇含量采用日本岛津公司生产的GC-2010Plus型气相色谱仪测定，乳酸含量采用美国戴安公司生产的Dionex Ultimate U3000型高效液相色谱仪测定，测定方法详见文献[5]。

1.6 试验方法

数据用Origin 8.5软件整理制图并利用修正的Gompertz方程拟合累积产气曲线。利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，P<0.05代表数据存在显著性差异，P>0.05代表数据不存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 湿贮存过程中理化特性及发酵产物动态分析

图1 秸秆湿贮存过程发酵品质的动态变化Fig.1 Dynamic changes of fermentation quality during wet storage

湿贮存过程中pH值、干物质损失率及可溶性碳水化合物含量的变化如图1a～1c所示。Con组湿贮存过程中pH值呈现先缓慢下降后升高的趋势，但在贮存期间pH值始终维持在6以上。干物质损失率随贮存时间的延长而增大，在贮存30 d时，干物质损失率为10%。初始可溶性碳水化合物占总固形物质量分数仅为1.6%，贮存过程中略有降低。Glu组在贮存3 d时pH值已低至4.8，在贮存30 d时pH值达到4.2，干物质损失率为4.7%，与Con组相比，干物质损失下降53%。与Glu组相比，LP组与LB组可加速发酵初期(3 d内)pH值下降速率及可溶性碳水化合物消耗；而贮存30 d时pH值和可溶性碳水化合物含量无显著变化(P>0.05)，LP组干物质损失率为4.6%，与Glu组相比无显著变化(P>0.05)，LB组干物质损失率为5.5%，略高于Glu组，是由于接种短乳杆菌属于异型乳酸菌，会产生二氧化碳造成少量干物质损失[15-16]。AA组初始pH值为6.75，贮存30 d时pH值为4.0，干物质损失率为3.6%，均显著低于其他组(P<0.05)。可溶性碳水化合物初期消耗较少，随着贮存时间的延长，可溶性碳水化合物含量呈线性下降趋势。pH值是最直接表征秸秆湿贮存效果的指标。秸秆pH值为4.1～4.3，质量良好；pH值为4.4～5.0，质量一般；pH值在5.0以上，质量劣等[17]，pH值越低秸秆湿贮存的效果越好，稳定贮存的时间越长。空白组的秸秆湿贮存品质较差，是由于其缺少可被乳酸菌直接利用的可溶性碳水化合物，导致乳酸、乙酸等有机酸含量低，pH值偏高，不能有效地抑制腐败菌(梭菌、芽孢杆菌、酵母菌等)分解有机物，产生二氧化碳或氨气等造成大量干物质损失[18]。其余组均添加了葡萄糖，贮存30 d均获得质量良好的原料，干物质损失显著下降(P<0.05)。

湿贮存过程中木质纤维素的变化见表2。Con组在贮存过程中，木质纤维素组分几乎没有显著变化。其余4组纤维素和半纤维素含量在数值上均有下降趋势，Glu 组纤维素含量贮存30 d时显著降低(P<0.05)，LP组、LB组和AA组贮存30 d的半纤维素含量显著低于贮存0 d(P<0.05)，所有组木质素含量均无显著变化(P>0.05)，湿贮存过程中秸秆长时间在低pH值的酸性环境，促进了部分纤维素、半纤维素的降解，这与刘桂要[7]的研究结果基本一致。与Glu组相比，额外添加乳酸菌与乙酸对纤维素、半纤维素含量无显著影响，HEIERMANN等[4]研究也表明乳酸菌对青贮玉米秸秆的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维无显著影响。

湿贮存过程中乳酸含量的变化见图1d。Con组乳酸含量初期略有升高，贮存15～30 d期间干基质量比维持在14 g/kg。Glu组乳酸含量呈现先增加后平稳的趋势，贮存至30 d时干基质量比为36 g/kg。与Glu 组相比，LP组呈现初期快速增加后期略有降低趋势，贮存至30 d时达到62 g/kg，乳酸含量显著提高(P<0.05)，FILYA等[19]研究也表明接种植物乳杆菌可显著提高乳酸含量；LB组贮存至30 d时，乳酸含量的干基质量比达到44 g/kg；AA组乳酸含量在发酵初期(7 d内)并无明显增加，但发酵后期呈迅速升高趋势，发酵至30 d时乳酸的干基质量比高达75 g/kg，显著高于其他组(P<0.05)。由图1c可发现，可溶性碳水化合物在发酵7 d后迅速被消耗，可以推测由于直接添加乙酸导致pH值快速降低，抑制了部分微生物活性，减少了贮存初期对可溶性碳水化合物的消耗，但随着发酵时间的延长，可在酸性环境下生长的乳酸菌大量繁殖，快速消耗可溶性碳水化合物产生大量有机酸。

表2 秸秆湿贮存过程纤维素、半纤维素和木质素的动态变化Tab.2 Dynamic changes of cellulose, hemicellulose and lignin during wet storage

注：同列不同小写字母表示相同处理组不同时间差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示相同时间不同处理间差异显著(P<0.05)。

湿贮存过程中乙酸含量的变化见图1e。Glu组与LP组贮存30 d时，乙酸的干基质量比分别为5 g/kg和6 g/kg，与Con组相比，并未显著增加(P>0.05)。而LB组在贮存3 d后，乙酸含量呈现先显著升高后平稳的趋势，贮存30 d时，乙酸的干基质量比达到12 g/kg，是由于短乳杆菌属于异型乳酸菌，代谢产物除了乳酸外，还有乙酸等。KLEINSCHMIT[20]研究表明玉米青贮料接种异型乳酸菌可提高乙酸含量。AA组在贮存30 d时，乙酸的干基质量比为20 g/kg,贮存期间乙酸含量的变化与乳酸含量的变化相一致，原因也相近。

湿贮存过程中丙酸、丁酸和乙醇含量的变化见图1f～1h。5个湿贮存组丙酸含量的干基质量比均低于2 g/kg。Glu组、LP组、LB组和AA组丁酸的干基质量比均低于2 g/kg。Con组在贮存15 d后，丁酸含量迅速增长，贮存30 d时干基质量比已高达29 g/kg，这是由梭状芽胞杆菌大量繁殖产生二次发酵导致的。据徐春城[21]报道，大多数梭菌通常出现在湿贮存后期，高pH值、低可溶性碳水化合物含量均有助于梭菌的繁殖，其在无氧条件下能分解单糖、双糖、乳酸、淀粉、纤维素以及有机氮化物等产生丁酸、二氧化碳与氢气等造成营养物质大量损失。LP组、LB组、AA组的乙醇含量均显著低于Con组与GLu组(P<0.05)。在贮存过程中，乙醇一般是乳酸菌、肠杆菌、酵母等微生物的代谢产物[21]，Con组的pH值较高，乙醇可能是肠杆菌或酵母的代谢产物，Glu组的pH值较低，可能是某些异型发酵乳酸菌的代谢产物。与LP组和LB组相比，AA组贮存7 d后，乙醇含量显著升高(P<0.05)，结合乳酸和乙酸含量变化，推测添加乙酸可能促进了某些异型乳酸菌的生长。

2.2 湿贮存前后细菌多样性变化分析

原料湿贮存前后化学组分及发酵品质的变化本质上是微生物菌群共同作用的结果。选取空白组贮存的0 d和30 d，其余4组贮存30 d的原料进行细菌多样性分析，分别为：Con 0、Con 30、Glu 30、LP 30、LB 30、AA 30。

由图2a可知，干黄玉米秸秆原料主要附着变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，丰度分别为50.05%、16.88%和24.66%，少量厚壁菌门(Firmicutes)和未定名Saccharibacteria的丰度分别为5.32%和2.45%，极少量蓝藻细菌门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)，四者丰度之和仅为0.59%。其余5组均是经过湿贮存，厚壁菌门丰度显著升高(P<0.05)，成为主要优势菌群，放线菌门显著升高(P<0.05)。变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和Saccharibacteria丰度显著降低(P<0.05)，这与陶莲等[22]的研究结果一致。

由图2b可知，干黄玉米秸秆(Con 0组)主要附着鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、短状杆菌属(Brachybacterium)、单胞菌(Luteimonas)等，丰度分别为20.54%、7.72%、6.37%、5.22%、4.99%。还有少量乳酸菌，如乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)等，丰度均低于0.5%，非乳酸菌属丰度高达99%。

图2 湿贮存前后门水平、属水平的细菌群落组成Fig.2 Composition of bacterial community at phylum and genus before and after wet storage

Con 30组，主要附着Weissella、Bacillus、Enterococcus、Pediococcus、Saccharomonospora、Nocardiopsis、Clostridiums.s，丰度分别为15.62%、8.75%、10.42%、7.35%、5.27%、5.53%、3.34%。Weissella、Enterococcus、Pediococcus等乳酸菌成为优势菌群。但对贮存更有利的Lactobacillus并未升高。KUNG[23]表明Pediococcus比Lactobacillus更适宜在高干物质及较高pH值的条件下生长。同时Clostridiums.s的丰度达到3.34%，而其余组的丰度均低于0.1%。这表明大量的梭菌繁殖，会发生丁酸发酵，造成干物质损失。这也是图1g中Con组的丁酸含量显著高于其他组的原因。

Glu 30组，主要优势菌群Lactobacillus、Bacillus、Enterococcus、Enterobacter、Pediococcus，丰度分别为11.11%、11.22%、9.01%、5.32%、6.88%。以乳杆菌属、肠球属、片球菌属等乳酸菌为主导产酸，这与PAHLOW等[24]研究一致。一般来说杆菌比球菌更耐酸性[21]，Glu组贮存30 d时pH值为4.2，肠球属与片球属已受到抑制，产酸缓慢，但乳杆菌并不占据绝对的主导地位，这也是Glu组的乳酸含量远低于LP组的原因。同时腐败菌Enterobacter丰度依然较高，会产生乙醇，这可能是Glu组乙醇含量高于LP组、LB组与AA组的原因。

LP 30组，主要优势菌群为Lactobacillus和Bacillus，丰度分别为41.07%、8.27%。乳杆菌属占乳酸菌的99%。乳杆菌较其他乳酸菌更适宜在酸性环境下生存，产酸速率更快。与Glu 30组相比，乳杆菌属相对丰度显著升高(P<0.05),结合乳酸含量变化(图1d)，推测这株同型发酵的植物乳杆菌在玉米秸秆湿贮存环境中较适宜生长，腐败菌Enterobacter、Clostridiums.s等相对丰度均显著下降(P<0.05)。

LB 30组，主要优势菌群为Lactobacillus和Bacillus，丰度分别为14.45%、13.17%，与Glu组相比，Lactobacillus丰度仅提高3.3%，与LP 30组相比，显著下降(P<0.05)，可能是接种量不足或这株短乳杆菌不适合在这种环境中生长。但腐败菌Enterobacter、Clostridiums.s相对丰度低于LP 30组，表明短乳杆菌与植物乳杆菌相比，可降低腐败菌的相对丰度，任海伟等[25]表明接种异型乳酸菌可有效抑制腐败菌。

AA 30组，主要优势菌群为Weissella、Bacillus和Lactobacillus，丰度分别为16.87%、14.97%、9.32%。与Glu 30组、LP 30组和LB 30 组相比，Lactobacillus相对丰度最低，而Weissella相对丰度最高，可见添加乙酸可能促进了Weissella生长，Weissella属于异型发酵，主要产物有乳酸、乙酸或乙醇。这可能是AA组贮存7 d后乳酸、乙酸和乙醇含量升高的原因(图1d～1h)。同时Enterobacter与Clostridiums.s相对丰度显著低于其他组(P<0.05)，表明添加乙酸强化了以Weissella为主导的异型发酵过程并抑制了腐败菌生长，增强了贮存过程稳定性。

2.3 湿贮存前后厌氧消化性能以及产气动力学分析

厌氧消化是多种微生物协同在厌氧环境下将有机物逐渐分解，产生甲烷这一能源物质的过程。已有研究表明玉米秸秆经过湿贮存可提高秸秆产气潜力[4]，为了进一步探讨复合添加剂对经过湿贮存的干黄玉米秸秆产气潜力的影响，选取了5组湿贮存试验贮存30 d的样品进行产气潜力试验，结果如图3所示。

图3 干黄玉米秸秆补充添加剂湿贮存后的产气潜力分析Fig.3 Methane production comparison of dry corn stover with additive after wet storage

Con 30组测定单位挥发性固体累积甲烷产量(264±1) mL/g。Glu 30组测定单位挥发性固体累积甲烷产量为(293±6) mL/g，其中每克葡萄糖理论产气量为373 mL[26]，除去每克原料中额外添加的葡萄糖理论产气量，经过计算Glu组中秸秆自身理论单位挥发性固体累积甲烷产量为(282±7) mL/g(计算理论值时，均不考虑添加剂损失)，与Con 30组相比，提高秸秆自身产甲烷潜力6.8%。

LP 30组测定单位挥发性固体累积甲烷产量为(289±7) mL/g，与Glu 30组相比，无显著变化(P>0.05)，MENARDO等[27]研究表明全株玉米秸秆接种同型乳酸菌对甲烷产气潜力无显著影响。菌剂添加量低于0.1 mL，对产气几乎无影响，除去葡萄糖的理论产气量，秸秆自身理论单位挥发性固体累积甲烷产量为(274±7) mL/g，与Con 30组相比，略有升高。

LB 30组测定单位挥发性固体累积甲烷产量为(282±3) mL/g，与Glu 30组相比略有降低。ZHAO等[28]研究，以柳枝稷为原料接种短乳杆菌，贮存30 d后甲烷产量显著升高。HAAG等[29]研究，全株玉米接种异型乳酸菌贮存后对甲烷产量无显著影响。这可能与原料理化特性、乳酸菌生长情况有关，短乳杆菌异型发酵会产生二氧化碳，造成部分有机物的损失，导致测定产甲烷潜力的降低。除去葡萄糖理论产气量，秸秆自身理论单位挥发性固体累积甲烷产量为(270±3) mL/g，与Con 30组相比，略有升高。

AA 30组测定单位挥发性固体累积甲烷产量为(299±1) mL/g，与Glu 30组相比，无显著变化(P>0.05)。除去葡萄糖与乙酸理论产气量[29]，秸秆自身理论单位挥发性固体累积甲烷产量为(287±1) mL/g，与Con 30组相比，提高秸秆自身产甲烷潜力8.7%。

采用修正Gompertz 方程对5组玉米秸秆厌氧消化过程进行拟合预测，其中Rmax、单位挥发性固体累积甲烷产量以及延滞期λ是反映厌氧消化效率的重要指标。结果如表3所示，5组决定系数R2均不小于0.98，表明方程对5组试验的厌氧消化过程有较好的拟合。Con 30组的延滞期为2.75 d，其余4组的延滞期均明显缩短，主要是由于原料添加葡萄糖经过湿贮存后产生的有机酸，加速厌氧消化过程中产甲烷菌的代谢过程，缩短了启动延滞时间。AA组的延滞期小于0.01 d，可能是由直接添加乙酸，乙酸可作为产甲烷菌的直接底物导致的。添加剂可显著缩短湿贮存干黄玉米秸秆的延滞期，有利于提高实际沼气工程的产甲烷效率和综合效益。采用修正Gompertz 模型得到的单位挥发性固体累积甲烷产量的预测值略低于批次实验得到测定值，差异比范围为4%～7%。这表明修正Gompertz 模型可以较好模拟补充了添加剂的湿贮存干黄玉米秸秆的厌氧消化过程。

表3 修正Gompertz方程预测的玉米秸秆厌氧发酵的产甲烷动力学参数Tab.3 Model estimation results of dry corn stover after storage by modified Gompertz models

添加剂调控玉米秸秆湿贮存过程，使得玉米秸秆产气潜力得以提高，主要归结于两方面原因，首先通过添加葡萄糖，增加了乳酸菌可利用底物浓度，快速产生乳酸，降低了秸秆贮存过程的pH值，抑制了腐败菌生长，降低干物质损失，更好地保存了营养物质。其次是木质纤维素长时间在低pH值的酸性环境中，部分纤维素、半纤维素降解为厌氧消化过程中易水解物质，木质纤维素结构得以改变，使得秸秆的产气潜力得以改善[30-31]。葡萄糖协同乳酸菌或乙酸添加分别起到调控有机酸分布和增强贮存过程稳定性的作用，其对进一步提高秸秆产气潜力的作用有限。

可见以干黄玉米秸秆为沼气工程原料时，外源糖的补充是保证其高效贮存及产气的关键。在实际工程应用中，为充分利用废弃物资源、降低工程运营成本，建议可结合当地实际情况，适当补充含糖量高的工业或农业废弃物进行混贮方式，例如糖蜜、苹果渣等。