菠萝产香菌的筛选与鉴定

2018-09-14玉云尹团章庞登红

湖北农业科学 2018年12期

关键词：发酵筛选

玉云尹团章庞登红

摘要：利用组织块法、匀浆分离法、富集分离法从菠萝中初筛得到8株产香菌，复筛出1株产花草香的菌株ZFF1。经形态学和分子鉴定，菌株ZFF1鉴定为葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），属于安全菌株。

关键词：产香菌；筛选；发酵；菌种鉴定

中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）12-0036-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.010

Abstract： Eight aroma-producing strains were screened preliminarily from pineapples by using the methods of tissue culture，homogenate separation，and enrichment and separation. And a strain，ZFF1 producing the fragrances of flowers and herbs from 8 strains was obtained after secondary screening. The strain ZFF1 was identified as Hanseniaspora uvarum by morphological and molecular identification，and it was safe.

Key words： aroma-producing strains； screening； fermentation； species identification

产香微生物是指在生长过程中可以发酵代谢产生香味物质的微生物，大部分为乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌和霉菌类，不同的产香微生物产生的香味物质各不相同[1-4]。利用微生物产香天然、安全健康、周期短、不受原料的限制，既可降低成本，又可提高香料产量[5-8]，已广泛应用于香烟、果酒、香水、化妆品等领域[9-13]。产香微生物主要来源于酒醋酱油等发酵產品、土壤、天然植物。自然界植物资源丰富，特别是具有特殊香味的植物多种多样，从植物组织分离已成为获得产香菌株的重要途径之一，已有从新鲜荔枝、西瓜和龙眼中分离得到产香菌株[14-16]。本试验拟从菠萝果肉中筛选产香菌株，以应用于烟叶、茶叶等领域。

1 材料与方法

1.1 材料

菠萝购于华中农业大学水果市场，茶叶为市售三级晒青茶。葡萄糖等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基 PDA固体培养基（Potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，加去离子水至1 L，pH 7.0，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。

PDA液体培养基：除不加琼脂外，其余同PDA固体培养基。

1.2.2 菌株分离及纯化分别采用组织块分离法[17]、组织匀浆法[18]和富集分离法[19]从菠萝果肉中分离产香菌，用PDA固体培养基对分离得到的菌株不断纯化，直到完全分离出单一菌株。组织块分离法、组织匀浆法和富集分离法分离得到的菌株分别用“ZKF+序号”“ZYF+序号”和“ZFF+序号”编号表示。

1.2.3 产香菌株初筛将上述分离纯化的单一菌株分别接入PDA培养基，以28 ℃培养2～3 d后，由3～4人感官评选出产香浓郁且风味怡人的产香菌，作为初筛菌种。

1.2.4 产香菌株复筛以1∶50茶水比进行沸水浸提10 min后，过滤，细菌瓶分装10 mL/瓶，以121 ℃高压蒸气灭菌21 min。将菌株接种茶汤中，设置对照（不接菌），置于28 ℃摇床中培养5 d，得菌种液。取灭菌茶叶（20 g/瓶），接种10 mL菌液，至茶叶含水量达到40%左右，分别设置空白、加无菌水、加无菌茶汤3个对照，于28 ℃培养箱培养10 d。参照黑茶审评标准，评价时侧重于茶叶香气，由5位审评员进行审评，评分权数为：总分=香气得分×40%+汤色得分×20%+滋味得分×30%+叶底得分×10%。依据得分高低，复筛出产香菌株。

1.2.5 产香菌株鉴定对复筛出的产香菌株进行形态学观察和分子鉴定。分别在光学显微镜和电子显微镜下观察菌株的显微结构。用试剂盒提取菌株DNA，根据形态观察结果选用合适的引物NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′进行PCR扩增。PCR扩增程序为94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环。反应体系为（100 μL）Taq（5 U/μL）0.8 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 μL，模板DNA 2.5 ng；引物NL-1（10 μmol/L）2 μL，引物NL-4（10 μmol/L）2 μL；ddH2O补足到100 μL。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳回收，对所得产物进行测序，以BLAST软件对所得序列进行同源性比对，将比对结果中同源性较高的序列挑选出并进一步采用MEGA4.1软件分析，构建系统发育树，确定产香菌株的种属[20]。

2 结果与分析

2.1 产香菌株的初筛

对分别采用组织块分离法、组织匀浆法和富集分离法从菠萝果肉中分离纯化的单一菌株进行感官初筛，共分离得到8株具有产香能力的菌株，结果见表1。由表1可以看出，ZYF2、ZYF3、ZYF5、ZFF3、ZFF4等具有果酒香气，香气怡人，但是经过长时间存放之后，其香气会变淡。ZFF1为米酒香，且香味浓郁，持续时间较长。初筛的大部分产香真菌均产酒香，这可能与使用PDA培养基有关，但各菌株的香气浓郁程度和类型仍然存在一定区别。初筛所获得的产香菌株中各有4株分别由组织匀浆法和富集分离法获得，表明采用组织块分离法不易分离获得菠萝果肉产香菌。

2.2 产香菌株的复筛

将初筛得到的8株产香菌进行复筛，经比较不同菌株发酵茶叶原料时的产香情况，筛选出最佳产香菌株，结果见表2。由表2可知，接种ZFF1和ZYF5的发酵样香气较好，分别为花草香和香料香。但从综合审评结果来看，ZFF1发酵茶样汤色橙红、明亮，滋味焦糖味、带花草香，叶底为猪肝色、带青色，得分为84.23；而菠萝ZYF5的发酵茶样，汤色橙红、明亮，滋味较醇正、带花草香、叶底猪肝色、带青色，得分为80.37。据此，选择ZFF1为复筛的最佳产香菌株。

2.3 产香菌株的鉴定

2.3.1 菌株形态特征从PDA培养基上可以看出，菠萝ZFF1为乳白色，菌体表面黏稠，但质地不均（图1A）。从显微图（图1B）和电镜图（图1C）可以看出，菌株个体形态为杆状，无鞭毛，菌株大小在5～10 μm。

2.3.2 菌株的分子生物学鉴定 26S rDNA（D1/D2）区域位于酵母核糖体大亚基的5′端，大小在600 bp左右，这段区域具有较高的变异率。同种菌株26S rDNA（D1/D2）核苷酸差异率较小，不同种菌株差异率较大。利用PCR扩增获得ZFF1菌株的26S rDNA（D/D2）序列，并测序，根据不同序列的相似性绘制系统发育进化树[21]。由图2可以看出，ZFF1菌株的26S rDNA（D/D2）序列与葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似性最高，为96%，因此初步确定ZFF1为葡萄有孢汉逊酵母。

3 小结与讨论

3.1 菠萝中可筛选产香菌

匡钰[22]从菠萝果皮中筛选出一株发酵性能较好的酵母菌，并采用原生体紫外诱变法对其进行诱变，得到一株发酵性能优良、适合菠萝果汁发酵的酿酒酵母，优化了菠萝果酒和菠萝果醋的发酵工艺。胡月英[23]从菠萝园的土壤和菠萝果实中经过四级筛选，选出最佳发酵菌株A4C3，并初步鉴定为酿酒酵母，该株酵母菌能耐受19%的酒精度，能耐受pH 1.5的酸度和浓度为300 mg/L的二氧化硫，有较大发展潜力。王鹏霄[24]从菠萝、草莓、苹果等水果中分离筛选出2株产香菌，分別鉴定为Hanseniaspora sp.（有孢汉逊酵母属）和Pichia caribbica（毕赤氏酵母属）。由菠萝产香菌相关研究情况可以看出，对菠萝产香菌的研究较少，现有的菠萝产香菌多为酵母菌，并且大多用于促进果酒发酵工艺，而筛选获得的产香菌可以应用于食品等领域中。本研究从菠萝果肉中筛选获得的ZFF1，与王鹏霄[24]从草莓中分离得到高产香料HDMF的有孢汉逊酵母相同，说明在菠萝果肉中容易分离得到葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），为进一步的开发应用提供基础。

3.2 产香菌因培养材料而改变香气

ZFF1菌株接种于PDA培养基中产浓郁米酒香，而接种于茶叶中复筛时产花草香，这说明在不同培养材料上能产生不同香气类型，这可能与产香菌发生作用的底物或菌种在不同环境中发酵效果不一致有关。后期需进一步对ZFF1发酵不同原料产香情况进行探究，寻找更加合适的发酵原料，并产生更加有特色的香气类型。其次，需探究ZFF1发酵过程中香气成分的动态变化，分析菌株对哪些香气成分影响较大。再者，根据香气成分的变化，对相关酶的酶活进行测定，探究ZFF1菌株产香机理。

3.3 产香菌应用展望

目前产香菌大多应用于烟酒及食品的生产加工。甄达文等[25]利用混合微生物发酵烟叶碎片，发现增香效果明显。袁丽[26]分别从鸭梨果皮、猕猴桃中分离筛选获得两株酵母，并应用于酿酒，发现酿制的鸭梨酒味道纯正、典型性好。张雪梅[27]从香肠中筛选产香葡萄球菌并将其用于发酵香肠，发现其有较好的产香性能。王刚等[28]从重庆泡菜及扬州豆酱等筛选得到1株季也蒙毕赤酵母，应用于面包发酵与烘焙，发现其面团发酵效果良好，且烘焙的面包囊风味独特。香精香料的生物合成中应用最广泛的生物技术是发酵工程，微生物法是生产较安全且有前途的方法[29，30]。利用微生物产香，所制取香料产物对果酒、果类饮料、香水、化妆品等领域都具有重大意义，还可以应用于茶叶发酵工艺中，促进茶叶香气、滋味等品质的提升。产香真菌在其他方面的应用还需要投入更多的研究。

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