灰树花多糖及其复合多糖对肺纤维化大鼠的作用

张立霞 林绪涛 李 军 杨 静 李 琳 赵 敏 倪艳波

(滨州医学院，山东 烟台 264003)

肺纤维化活动性进展具有隐蔽性，预后很差，患者往往因为呼吸衰竭导致死亡。肺纤维化的常规治疗可以延迟肺纤维化患者的病程进展时间，但很难从根本上治愈肺纤维化〔1〕。本研究用博来霉素气管内注射制作较符合肺纤维化病理发展过程的肺纤维化模型，使用非常规食药两用患者多糖预干预提高动物机体的抵抗力及免疫调节能力，观察其能否在肺纤维化的发展过程中起到较好的抵制作用。肺纤维化具有一定的遗传因素和高危人群，如长期接触粉尘、煤尘等的人群，如果灰树花多糖能通过改善抵抗力和免疫功能，对肺纤维化的发生及进展有抵制作用，将是一种较好的预防手段。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器 SD大鼠，雄性，体重180～200 g，购自烟台绿叶科技有限公司，随机分为模型组、灰树花多糖组、灰树花复合多糖组，每组20只。灰树花多糖：购自浙江方格；博来霉素：日本化药株式会社，批号：Y20262；波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、免疫荧光抗体二抗：武汉博士德生物工程有限公司；倒置显微镜，奥林巴斯株式会社；激光共聚焦扫描显微镜，德国莱卡；IX71倒置荧光显微镜，奥林巴斯株式会社。

1.2实验方法

1.2.1肺纤维化大鼠模型的建立 SD大鼠适应性饲养1 w，4%水合氯醛以1 ml/100 g腹腔注射进行麻醉，腹部朝上固定在大鼠操作台上，将脖颈处的毛发剃除暴露皮肤，75%乙醇及碘伏消毒皮肤，手术刀切开皮肤，用眼科剪刀及镊子小心地剥除气管上肌肉、筋膜、脂肪等组织暴露气管，将气管剪开一个V形小口，插入注射器针头，将博来霉素以5 mg/kg注射入大鼠气管内，拍打、摇晃大鼠使气管内的博来霉素分散至肺部各区域。

1.2.2灰树花多糖给药 将1 g灰树花多糖/灰树花复合多糖加入50 ml生理盐水内制成灰树花多糖/灰树花复合多糖溶液，以1 ml/100 g灌胃给药。在制作肺纤维化大鼠前预给药7 d。

1.2.3Aschcroft评分 在光镜下对HE染色组织切片病灶纤维化程度半定量分析，将组织纤维化程度分为0～8级。将每个样本随机选30个视野进行评分，取所有视野评分值的均数作为该样本纤维化的程度评分。具体标准如下：0级，肺组织正常；1级，细支气管和肺泡壁轻度纤维化；3级，细支气管和肺泡壁中度纤维化，但无明显的肺组织结构破坏；5级，明显纤维化伴有肺组织结构破坏和纤维条带或纤维小结节形成；7级，严重肺组织结构变形或出现大面积纤维灶；8级，整个视野全部出现纤维化病灶；位于两奇数间者即为相应偶数级。结果判断：每个样本随机选30个视野进行评分，取所有视野评分值的均数作为该样本纤维化程度评分。

1.2.4Masson染色 步骤：中性甲醛固定组织，常规脱水，石蜡包埋后切片，常规脱蜡入水，Masson复合染色液染色5 min，0.2%醋酸水溶液冲洗，5%磷钨酸染色10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，苯胺蓝染色5 min，0.2 %醋酸水溶液水洗2次，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Masson染色根据染料分子大小的不同染色，将胶原纤维染成蓝色，肌纤维等染成红色。

1.2.5波形蛋白及α-SMA免疫荧光染色 激光共聚焦显微镜观察。免疫荧光染色步骤为中性甲醛固定组织，常规脱水，石蜡包埋，石蜡切片，常规脱蜡入水，热抗原修复，10%羊血清封闭30 min，甩掉封闭液不冲洗加稀释好的一抗4℃冰箱过夜后37℃恒温培养箱孵育1 h，0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，加入稀释好的二抗放入37℃恒温培养箱孵育30 min，0.01% PBS冲洗3遍，中性甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行析因分析。

2 结 果

2.1灰树花多糖对肺纤维化大鼠死亡率的影响 灰树花多糖组在前期能降低肺纤维化大鼠的死亡率，但后期大量死亡，并未降低肺纤维化大鼠的总死亡率(表1)。

表1 各组大鼠的死亡数目(n,n=17)

2.2灰树花多糖对肺纤维化大鼠生存状态的影响 造模6 w后，灰树花多糖及灰树花复合多糖组大鼠毛发光泽，活动活跃，但仍有呼吸急促，咳嗽，有时可见鼻出血，证明大鼠肺部损伤仍较严重。模型组大鼠毛发粗糙，活动迟缓，呼吸急促，咳嗽，可见鼻血。

2.3灰树花多糖对大鼠体重的影响 各时点，各组大鼠体重比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 各组大鼠体重比较

2.4灰树花多糖对大鼠肺脏损害的影响 与模型组比较，灰树花多糖及灰树花复合多糖组大鼠肺脏标本HE染色后Aschcroft评分分别为(5.80±1.58)、(5.63±2.13)分，与模型组〔(5.57±2.13)分〕差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5各组肺脏组织形态学观察 灰树花多糖组、灰树花复合多糖组及模型组肺脏标本，HE染色后均可见大面积肺纤维化结节灶，结节灶内肺脏正常结构消失，纤维组织增生，可见典型的成纤维细胞，细胞体积较大，胞质红染，细胞核大。Masson染色显示纤维化结节灶中可见大量的胶原纤维增生(图1)。

图1 各组肺脏标本HE染色及Masson染色(×400)

2.6各组肺脏组织纤维化相关蛋白表达比较 激光共聚焦下观察发现，各组标本均有大量纤维灶，波形蛋白及α-SMA的表达无明显变化，较正常的肺脏组织处两种蛋白的表达较弱，纤维灶处波形蛋白及α-SMA高表达(图2)。

图2 各组肺脏波形蛋白及α-SMA免疫荧光染色(×400)

3 讨 论

随着真菌多糖纯化工艺的提高及对其的研究越来越多，人们对真菌多糖的认识和接受度也越来越高，香菇多糖、灰树花多糖、茯苓多糖及猴头菇多糖等多种真菌多糖已应用于临床。目前，香菇多糖，灰树花多糖仍是研究及使用较广泛的两种真菌多糖，其主要功能是作为免疫调节剂及对抗癌的辅助药物〔2～4〕。国内外实验研究表明，从灰树花子实体提取的多糖具有抗肿瘤作用,并有一定预防肿瘤的效果，目前对于抗肿瘤的研究主要集中在卵巢癌、乳腺癌等，对于肺损伤的研究相对较少〔5，6〕。本研究在前期工作对大剂量灰树花多糖使用的安全性进行了评估，并确定了最佳的给药剂量〔7〕。复合多糖是指对不同种类的活性真菌多糖进行高度浓缩、提纯、复壮而成的系统真菌多糖营养，各真菌多糖之间的营养、药理作用呈现协同性〔8〕。相比单一的真菌多糖，复合真菌多糖具有的生理活性和保健功能更全面，本研究采用以灰树花多糖为主，佐以香菇多糖、云芝多糖及甘草酸，其免疫调节功能要优于灰树花多糖单独使用。

本实验研究选用用大鼠气管内注射博来霉素来制作大鼠的肺纤维化模型〔9〕，这一模型是较接近肺纤维化病理过程的实验动物模型，早期肺泡炎，间质性肺炎，肺泡上皮受损，成纤维细胞增生，巨噬细胞、中性粒细胞等炎性浸润，由此导致细胞外基质成分在肺泡和间质内沉积及纤维组织的过度修复造成的肺组织结果的紊乱，肺实质损伤，慢性肺纤维增生，肺间质纤维化，胶原沉积，肺泡结构改变，最终发生肺纤维化，其病理发展与人的肺纤维化进展相似。

本研究发现灰树花多糖及复合多糖并没有提高肺纤维化大鼠的最终生存率及肺脏结构的损伤但可以改善其生存状态，对博来霉素造成的大鼠肺部变化也无明显的改善。

通过对灰树花多糖及其复合多糖在肺纤维化大鼠的作用预测，在肺纤维化患者中或肺癌患者中使用灰树花多糖可以改善其基本状况，但不能作为治疗药物单独使用，具体情况需要经过进一步实验研究。