不同浓度DAPT对体外培养的糖尿病大鼠动脉血管平滑肌细胞增殖影响的研究

范东旭 刘彦东 薛金枝 王瀚锐 程明勋 金松

【摘要】目的 探讨不同浓度DAPT对体外培养的糖尿病大鼠动脉血管平滑肌细胞增殖的影响，探寻适宜浓度，为研究糖尿病血管再生奠定基础。方法 取已完成鉴定冻存的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞，进行复苏与传代，分为实验组和对照组。对照组不加抑制剂，实验组不同浓度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L），观察0、12、24、48、72 h后进行MTT监测。结果 DAPT对DM大鼠VSMCs有抑制作用，这种抑制作用在0.15～7.50 μmol/L浓度之间呈时间-浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05），7.50 μmol/L浓度以上无明显变化，无统计学意义（P>0.05）；根据作用曲线，各时间段DAPT对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率大约出现在0.15 ?mol/L和2.50?mol/L，且72小时时对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率较其余各时间段明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 DAPT对DM大鼠VSMCs有抑制作用，一定浓度之间呈时间-浓度依赖性，浓度过低或过高均无抑制作用，为糖尿病血管再生提供了新位点。

【关键词】血管平滑肌细胞；体外原代培养；γ-分泌酶抑制剂（DAPT）；MTT

【中图分类号】R363 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095.6681.2018.06.16..02

随着糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐渐增加，引起血管外科医生高度重视，对糖尿病患者血管再生的研究成为热点，相关研究证明，Notch信号通路能促进非糖尿病动物缺血区的血管新生、动静脉分化等，本课题应用不同浓度的γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对Notch信号通路的关键酶γ-分泌酶进行抑制，探寻适宜血管再生的浓度，为进一步研究DM下肢缺血区血管新生提供实验理论依据。

1 材料与试剂

1.1 组织来源

已完成鉴定冻存的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞。

1.2 试剂

0.25%胰酶细胞消化液 invitrogen 公司，TRYPSIN 0.25%EDTA（25200056 Life），D-PBS （sh30028.01B Hyclone），D-Hanks液（不含Ca、Mg）（sh30030.03B Hyclone），γ-分泌酶抑制劑（DAPT）（美国Sigma公司），细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（MTT BB-4201贝博生物）。

1.3 培养基

在DMEM培养液（Gibco BRL，USA）培养基中添加15%胎牛血清（南美）（sv30087.02 Hyclone）、1%青霉素、1%链霉素，200目筛，一次性过滤除菌器除菌备用（4周内用完）。

1.4 器械及仪器

T25培养瓶，倒置显微镜，细胞计数板、超净工作台，96孔细胞培养板Corning Inc等。

2 方 法

2.1 细胞复苏及传代[1-2]

从液氮罐中取冷冻管，迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，使其1 min内完全融化，然后在超净工作台中打开冻存管，用吸管将细胞悬液注入离心管中，滴加10ml 培养液；然后1000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1*10g/L，置37℃ 5%CO2培养箱中培养，次日更换养液，继续培养，观察生长情况，若细胞在80%～90%融合时即可细胞传代，以后根据情况在长满1～2天后开始传代；所有操作均在超净工作台中进行，将细胞悬液按1：2传代培养，加入培养基悬浮细胞后，置37℃、5%C02培养箱中培养，每3 d换培养液一次，传代至第3代时可进行MTT实验。

2.2 MTT实验[3]

用0.25%胰蛋白酶消化并收集DM大鼠VSMCs，计数细胞，制成细胞悬液。以2.0×104/ml、200 μl/孔接种于96孔板上，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养24小时。将γ-分泌酶抑制剂DAPT储存溶液倍比稀释为工作液终浓度分别为0.15、0.30、0.45、0.6、0.75、1.25、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L，对照组不加，按浓度于96孔板上设置12排/板，共设置10个板；分别于0、12、24、48、72小时取出96孔板，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清；每孔加入150 μl DMSO：无水乙醇=1：1的混合液震荡10分钟，使结晶物充分溶解；在酶标仪上，以波长570 nm测定各孔光密度（Optical density，OD）值；以（OD测定孔-OD空白孔）表示每组的实际OD值；以正常对照组的细胞活力为100%，各实验组的细胞活力=OD实验组的实际值/OD对照组的实际值。

3 结 果

与对照组相比，不同浓度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L）对DM大鼠VSMCs有抑制作用，这种抑制作用在0.15～7.50μmol/L浓度之间呈时间-浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05），7.50μmol/L浓度以上无明显变化，无统计学意义（P>0.05）；根据作用曲线，各时间段DAPT对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率大约出现在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L，且72小时时对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率较其余各时间段明显，差异有统计学意义（P<0.05）。

4 讨 论

糖尿病血管并发症是糖尿病患者主要致残、致死原因[4]。流行病学调查研究表明，糖尿病患者发生心脑血管并发症的危险性较正常人增加34倍，血管平滑肌细胞（VSMC）是动脉壁的主要组成成分，在糖尿病血管并发症的动脉粥样硬化形成中起着关键作用，因此对VSMC 的研究有着重要的意义。相关研究证明：Notch信号通路能促进非糖尿病动物缺血区的血管新生、动静脉分化等；本课题证明题DAPT对DM大鼠VSMCs有抑制作用，这种抑制作用在0.15～7.50μmol/L浓度之间呈时间-浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05），7.50 μmol/L浓度以上无明显变化，无统计学意义（P>0.05）；根据作用曲线，各时间段DAPT对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率大约出现在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L，且72小时时对DM大鼠VSMCs细胞的半抑制率较其余各时间段明显，差异有统计学意义（P<0.05）。证明Notch信号通路通过受体、配体、下游信号等各种蛋白共同作用下，在一定程度上可促进糖尿病患者下肢缺血区的血管再生，随着对Notch信号通路研究的深入和对血管新生影响机制的阐明以及促血管或抑制血管新生方法的不断完善，一定能为相关血管疾病治疗提供重要策略和新的靶点。

参考文献

[1] 杨 婷，金 松，刘彦东.糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养方法的改良[J].中国普外基础与临床杂志， 2014， 21（2）：173-176.

[2] 司徒镇强.细胞培养[M].第二版.北京：世界图书出版社，2007.

[3] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].第二版.北京：中国协和医科大学出版社，1999.439-441.

[4] Laakso M. Hyperglycemia and cardiovascular disease in type 2 diabetes[J].Diabetes，1999，48（5）：937-942.

本文编辑：吴宏艳