响应面法优化蛹虫草多肽提取工艺研究

贾洪伟 李丹 王冰梅 徐广宇 张德花 苑广信

【摘要】目的：对蛹虫草多肽提取工艺进行了优化研究；方法：以蛹虫草子实体提取多肽为对象，通过Box-Behnken设计星点响应面实验进行优化实验；结果：优化蛹虫草多肽提取工艺为提取最佳时间为5.39小时，加酶量1.65%，底物浓度9.3%，蛹虫草多肽提取的OD值为0.85g/L；结论：经实验得证，通过星点响应面实验方法进行蛹虫草多肽提取工艺条件优化，结果合理有效，优化效果良好。

【关键词】蛹虫草；响应面；工艺优化

响应面面优化实验则能够对多因素多水平筛选最优条件，获得理想的结果，是目前优化工艺中常用的优化方法[3]。本文通过设计星点Box-Behnken响应面实验，以蛹虫草为对象，对多肽提取方法条件进行了优化研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

虫草子实体（沈阳妮子北冬虫夏草种植基地）。

1.2 试剂

胃蛋白酶（活力：30003500u·mg-1）、胰蛋白酶（活力：250u·mg-1），均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，石油醚（30～60℃），茚三酮。

1.3 北冬虫夏草多肽的提取工艺

脱脂：将北冬虫夏草子实体粉碎，取定量粉末，按1：3（w：v）比例加入石油醚，在55℃恒温下振荡3h，过滤，将滤渣烘干获得脱脂粉。

酶解过程：取3g北冬虫夏草脱脂粉，按底物浓度不同加入一定量蒸馏水，常温静置30min。用NaOH溶液或HC1溶液调节至酶的最佳pH水平，按加酶量不同加入定量蛋白酶，将样品置恒温振荡器中进行水解。水解结束后，样品煮沸10min，使酶失活，冷却，4500r·min-1离心10min，取上清液备用。

1.4 实验仪器

THZ-C恒温振荡器（太仓市实验设备厂），UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津国际贸易有限公司）54308低温高速离心机（美国eppendorf公司），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.5 星点设计

本研究根据星点设计原理，利用Design-Expert.8.06软件，对蛹虫草多肽提取工艺：时间（因素A）、加酶量（因素B）、底物浓度（因素C）進行了优化试验。本试验采用三因素三水平对提取工艺进行优化，因素水平见表1，并对所得数据进行二次回归拟合，求得回归方程。

2 结果与分析

2.1 Elisa响应面优化实验设计

对模型进行方差分析，结果见表2。由表2可以看出：模型的P<0.0001，表明模型高度显著，并能解释97.86%的响应值变化（调整确定系数R2=97.86）。通过上述所得数据，表明该模型具有良好的拟合度及较小的实验误差。

由回归方程系数显著性检验（表2）可知，因素A和因素B对蛹虫草多肽提取影响显著，而因素C对蛹虫草多肽提取影响不显著；因素A^2和C^2对蛹虫草多肽提取影响其曲面效应显著，而B^2对蛹虫草多肽提取影响曲面效应不显著；因素AC和BC对蛹虫草多肽提取影响很显著，因素AB对蛹虫草多肽提取影响效应比较显著。

我们又对实验结果进行响应面分析，结果见图1至图30从图1至图3中可以直接看出其中两两影响条件的交互作用是否互相影响，圆形（图1）表示两两影响条件互相作用不显著，而椭圆形（图2图3）则表示两两影响条件互相作用显著。

从图1中可以看出，在底物浓度为9.3%时，提取时间与加酶量的交互影响不显著。图2显示了在加酶量为最佳（1.65%）时，提取时间与底物浓度对蛹虫草多肽提取影响效应。从其等高线图可以直观的看出此两因素的交互作用比较显著。由图2可知，提取时间与底物浓度都很高时，蛹虫草多肤提取效率高，都低时蛹虫草多肽提取效率低。由此可知，在实验水平范围内，适当调整提取时间与底物浓度。图3显示了在提取时间（5.39小时）时，加酶量与底物浓度对蛹虫草多肽提取的交互影响效应。从其等高线图可以直观看出此两因素的交互作用显著，加酶量与底物浓度存在交互作用。由等高线图和响应面图可知，回归模型存在最大值，即在提取最佳时间为5.39小时，加酶量1.65%，底物浓度9.3%条件下，蛹虫草多肽提取的OD值最大值为0.87。

2.2 重复性实验验证

在优化后的蛹虫草多肽提取工艺下进行5组平行试验，所得蛹虫草多肽提取量的OD值分别为0.86、0.84、0.84、0.85、0.85，平均值为0.85。通过软件所得的预测值为0.87与验证试验的平均值0.85非常接近，证明应用响应面法优化蛹虫草多肽提取工艺可行。

3 结论

实验结果证明，采用Box-Behnken统计学实验设计方法对蛹虫草多肽提取工艺进行优化，不仅科学合理，而且快速有效。

（通讯作者：苑广信）

参考文献

[1]郑壮丽，黄春花，梅彩英等.蛹虫草国内外研究的新进展[J].环境昆虫学报，2011，33（02）：225-233.