大白菜转基因选择剂卡那霉素的浓度筛选

齐仙惠，李梅兰，巫东堂，李改珍，赵军良

（1.山西省农业科学院蔬菜研究所，山西 太原 030031；2.山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801）

大白菜（Brassica rapa subsp.pekinensis）属十字花科芸薹属植物，又称结球白菜、包心白菜、黄芽白、胶菜等，是一种原产于我国的蔬菜。其具有抗寒、适应性强、味甘等特点，营养价值很高。因此，大白菜的栽培和育种研究越来越受到人们的关注[1]。近年来，植物遗传转化已成为应用生物学研究的热门课题，为蔬菜品种的改良开辟了一条新途径。目前，植物遗传转化中常用的2类选择剂分别是除草剂类和抗生素类。其中，抗生素类的卡那霉素（Kan）是植物转基因研究中最常用的筛选标记[2-3]，已被成功应用于黄瓜[4]、烟草[5]、水稻[6]、棉花[7-8]、花生[9]、菊花[10]等植物。由于不同物种和基因型以及外植体材料对Kan浓度的敏感性存在较大差异[11]，所以，需要针对具体的研究材料进行Kan最佳筛选浓度的确定。

本试验拟研究不同浓度Kan对7#和9#大白菜幼苗生长发育的影响，通过比较2个品系在不同处理条件下的种子发芽率、子叶黄化率、下胚轴长度和幼苗鲜质量等，以筛选出2个大白菜品系的最佳选择浓度，旨在为今后筛选转基因大白菜植株奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

供试大白菜品系为7#和9#自交系。试验试剂有卡那霉素（上海生工公司）、氯化汞、吐温（Tween-20，美国BBI公司）、乙醇。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制 试验采用MS基本培养基，以30 g/L蔗糖为碳源，添加6.5 g/L的琼脂粉，调节pH值至5.8，用灭菌锅在121℃下灭菌20 min。灭菌后待培养基冷却至50℃左右时添加Kan，使培养基中 Kan 的终质量浓度分别为 0，100，150，175，200，225，250 mg/L。

1.2.2 种子消毒 取7#和9#大白菜种子，分别用无菌水冲洗干净后，在无水乙醇中浸泡1 min，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min，其中加一滴Tween-20，最后用无菌水冲洗5次。消毒后分别播种于含有不同浓度Kan的MS培养基上，每个处理50粒种子，重复3次。

1.2.3 培养条件和植株生长状态调查 将培养基置于培养温度为（25±1）℃、光照强度为1 500～2 500 lx，光/暗为16 h/8 h的培养室中，待种子萌发后统计各处理的发芽率并观察幼苗长势；培养7 d后统计各处理幼苗的子叶黄化率、下胚轴长、主根长、侧根数以及幼苗鲜质量。下胚轴的长度为下胚轴基部至芽顶端的长度，主根的长度为下胚轴基部至主根尖端的长度，侧根数为根长大于1 cm的第1侧根数。

1.3 数据统计与分析

采用SAS软件对生长于不同Kan浓度下的2个大白菜幼苗的种子发芽率、子叶黄化率、下胚轴长、主根长、侧根数以及幼苗鲜质量进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度Kan对种子发芽率及子叶黄化率的影响

将7#和9#大白菜种子接种到含Kan的培养基中，培养3 d后，种子陆续发芽。由统计结果可知（表1），除个别种子外，2个品种中几乎所有的种子都能正常萌发，说明Kan的不同浓度对大白菜种子的萌发基本没有影响。

表1 不同质量浓度Kan对7#和9#种子发芽率和子叶黄化率的影响 %

培养7 d后，在不含Kan的培养基中，7#和9#的幼苗生长健壮，没有出现子叶黄化现象。在添加了Kan的培养基中，随着Kan质量浓度的增加，子叶黄化率明显增加，并有部分幼苗因黄化严重而死亡（图1）；当Kan质量浓度为175 mg/L时，7#和9#大白菜的黄化率分别为91.89%和83.72%；当质量浓度为225 mg/L时，二者的子叶黄化严重，黄化率分别为100%和97.22%；当质量浓度为250 mg/L时，二者的黄化率均高达100%（表1）。

2.2 不同质量浓度Kan对幼苗生长的影响

幼苗在不含Kan的培养基中培养7 d后，植株生长健壮，子叶充分展开，大而浓绿，下胚轴正常生长，根系发达，侧根较多（图2）。其中，7#和9#的下胚轴长分别为3.13，1.76 cm，主根长分别为8.73，8.90 cm，分别具有 7.30，5.57条侧根（表 2，3）。

在添加Kan的培养基中，2个品种的子叶伸展不充分，小而发黄，植株矮化严重，下胚轴和主根明显短缩，根系不发达，没有侧根（图2）。随着Kan质量浓度的增加，7#和9#幼苗的下胚轴长和主根长、鲜质量均呈下降趋势，且显著小于对照植株 （表2，3）。

表2 不同质量浓度Kan对7#大白菜幼苗生长的影响

表3 不同质量浓度Kan对9#大白菜幼苗生长的影响

2.3 最佳Kan筛选浓度的确定

利用Kan作为选择剂，一般要求其既能有效抑制非转化细胞的生长，使之缓慢死亡，又不影响转化细胞的正常生长[12]。本试验中，100～250 mg/L的Kan均能有效抑制7#和9#大白菜幼苗的生长。其中，7#大白菜，在100 mg/L的Kan质量浓度下，子叶黄化率偏低（78.39%）；在200 mg/L的质量浓度下则偏高（97.33%）；在150，175mg/L的质量浓度下，子叶黄化率差异不显著，均在90%左右，因此认为，7#大白菜的最佳筛选质量浓度为150～175 mg/L。大白菜9#，在175 mg/L的Kan质量浓度下，子叶黄化率偏低（83.72%）；在225 mg/L的质量浓度下则偏高（97.22%），因此认为，9#大白菜的最佳筛选质量浓度为200 mg/L。

3 讨论

张丽华等[13]对4个加工番茄品种的Kan抗性进行了筛选，结果显示，不同部位对Kan的敏感度不同：幼苗对Kan比子叶外植体敏感，而子叶外植体又比下胚轴外植体敏感。在本试验中，Kan对根长、下胚轴和植株鲜质量的增加均有负面影响，且对根长的影响比对下胚轴和鲜质量的影响大，可能是由于植株的不同部位对Kan的敏感性不同，也可能与根系直接生长在培养基中有关[14]。而2个品系大白菜种子的萌发并未受到Kan的影响，各浓度处理下的种子均表现出与对照组基本一致的发芽率，这可能是由于有种皮的保护导致其对Kan的敏感性较差，以及其只接触培养基表面的原因。

Kan已被广泛应用于遗传转化的选择上，利用合适浓度的Kan进行转化植株的筛选非常关键。筛选浓度太高，会影响转化种子发育为正常植株，筛选浓度太低又会有太多的逃逸体，从而加大后期鉴定工作的强度。不同物种和基因型对Kan浓度的敏感性有差异。张甲佳等[9]对4个花生品种的Kan敏感性进行了研究，结果表明，不同品种的花生胚小叶对Kan的敏感性差异较大，其中，D16的Kan敏感性最高，临界质量浓度为100 mg/L；其次是J11和鲁花11，临界质量浓度均为150 mg/L；而花育22的敏感性最低，临界质量浓度达到200 mg/L。张静等[15]研究也认为，Kan对萝卜种子萌发及生长发育有明显的抑制作用，随着Kan浓度的升高，致死率升高，主根和下胚轴长度变短。且不同品种对Kan的敏感性不同，在经Kan溶液浸泡后播种时，07Lb36-9和07Lb39的Kan致死浓度分别为150，300 mg/L。本试验中，7#和9#大白菜对Kan的敏感性也有所不同，其中，7#比9#敏感性高，故其所需的最适筛选浓度较低。但在大白菜遗传转化试验中，不同品种的抗性浓度仍需进一步研究。

4 结论

本试验利用不同浓度的Kan对7#和9#大白菜进行处理，观察子叶期幼苗生长情况并进行数据统计分析，研究结果显示，随着Kan浓度的增加，大白菜种子的萌发没有受到影响，但子叶的黄化率随之增加，下胚轴和主根的长度变短，鲜质量减轻，侧根数减少。此外，不同大白菜品系对Kan的敏感程度不同，7#大白菜的Kan最佳筛选质量浓度为150～175 mg/L，9#大白菜则为200 mg/L。这些结果可为其他大白菜品种的抗性浓度筛选提供参考。