心室辅助装置溶血检测及关键问题研究

侯晓旭，李澍，王浩，罗维娜，王权，任海萍

中国食品药品检定研究院 医疗器械检定所，北京 102629

引言

目前除心脏移植外，心室辅助装置已经作为一种临床上可供考虑的选择，对心力衰竭的病人进行辅助，提高患者的生活质量和生存率[1-2]。目前市面可用的心室辅助装置基本都是连续旋转式血泵（轴流泵和离心泵），溶血性是这些装置的关键性能为之一，用于评价血泵对血液的损伤程度。从不良事件反馈上看，目前出现的中风等术后不良反应都与血泵溶血性能有关[3-4]。因此，量化心室辅助装置的血液损伤程度、评价系统的溶血性能对质量评价至关重要[5]。

从本质上讲，造成心室辅助装置溶血的根本原因是机械剪切力和应力暴露时间[6]。不同于人体心脏的容积变化式的血流驱动，旋转式血泵通过叶轮旋转（一般都在1000 rpm以上），为血流提供动力[7]。可以想象，在如此高速的旋转过程中，红细胞会受到很大的剪切力作用，从而引起细胞的变形（收缩和拉伸）。当长时间暴露在强剪切力条件下，细胞变形超过细胞所能承受的程度，暴露时间超过了人体的自我修复速度，红细胞可能失能而破裂，从而使细胞内的血红蛋白游离到血浆中[6,8]。

标准溶血指数（Normalized Index of Hemolysis，NIH）是定量衡量溶血的特征指标[9-10]。通过相对规范化的NIH测量可以定量了解血泵对血液的破坏程度。一般认为NIH值大于＞0.1 g/100 L，则认为出现溶血。ASTM F1841-97[11]标准对连续流血泵的溶血测试给出了指导方法，血泵需经过6 h溶血测试，每1 h进行一次血液采样，最终用6 h测试的NIH平均值来评价血泵的溶血性能。本文在ASTM F1841-97的基础上，针对标准中未进行详细说明的部分进行细化和讨论。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 血液采集的要求

血液采自正常体温、明显的疾病特征的动物血液，采集前禁食12 h。用大孔针（14 G）通过血管穿刺采集血液，并采集到含有肝素的标准血袋中。采血过程通过重力作用自然流出，或使用不超过100 mmHg的负压引出。血液从采集到使用建议在24 h以内，并在2℃～8℃环境下冷藏保存。血液在使用时推荐在37℃±1℃水浴下加温至生理温度。在水浴过程中要特别注意小气泡的产生，这些小气泡宜在进行体外实验前通过取样口进行消除。为了去除血液中的微粒、微血栓和聚集的血小板，在血液进入循环时用一个口径为74 μm的滤网对血液进行过滤。

1.1.2 测试回路及工作条件

封闭测试回路包括一根总长为2 m，内径为9.5 mm的聚氯乙烯管，血袋（12 cm×12 cm），压力传感器，流量传感器和待测试血泵。首先回路中应充满生理盐水，以清洗并湿润所有与血液接触的表面。在加血液之前，应通过采样口去除回路中的小气泡。根据血液初始血气分析结果以及目标红细胞压积值，计算灌注血液目标体积和生理盐水目标体积。按照目标体积从回路中抽出多余的生理盐水，同时向回路中注入目标体积的血液，注意避免回路中产生气泡。用以控制压力条件的阻力阀应放在泵的出口侧。在测试回路的入口及出口处连接压力表，见图1。泵的流量应设定为（5±0.25）L/min，循环血液温度为37℃±1℃。压力设定为（100±10）mmHg[12-13]。

图1 测试回路

1.2 实验方法

1.2.1 实验步骤

图1中描述了溶血测试的标准闭合回路，该回路由一台被测试的泵、血袋、三通采样口、压力传感器及一个阻力阀组成。血液被加热到37℃，通过重力作用经过三通管灌输到测试回路中。开启血泵，将其调整到待测试的试验条件。在测试回路运行大约5 min，并且回路中的气泡已排出之后，通过采样口采集第一个血样，作为0时间点的血样。

测试周期为6 h，在血泵循环5 min后采集第一个血样，之后每隔1 h采集一次，共计6个血样。为了确保采样的准确性，在采集血样之前，对血袋进行轻轻地挤压，并舍弃采样口附近的2 mL血样。在整个测试周期中循环血液温度宜保持在37℃±1℃。

1.2.2 采样过程

在循环期间，每小时从血袋中采集3～8 mL的血样。在每次采样时，采集两份血样，将第一次取的样品丢弃，因为它可能会含有滞留在采样口的一些血液。第二次采集的血样应用于测量血浆游离血红蛋白。

1.2.3 游离血红蛋白浓度的测试

采集的血液通过离心法获得上清血浆[14-15]。血浆中的游离血红蛋白通常以氧合血红蛋白的形式存在，将血浆使用0.1%碳酸钠溶液稀释后其在415 nm处存在强吸收峰，采用微孔板分光光度计（酶标仪）在415 nm波长处读数测定氧合血红蛋白吸光度值，并通过在380 nm和450 nm波长处的读数消除血浆中尿卟啉的干扰。计算公式如下：

配 制 了 2.5、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150 mg/dL浓度的血红蛋白溶液，并加入0.01%的Na2CO3稀释。最终测试结果如下，以血红蛋白的吸光度对样品浓度进行回归分析，并得到标准浓度曲线：y=0.0018x+0.00123（图2）。血红蛋白浓度与吸光度在2.5～150 mg/dL范围内均成线性关系，相关系数达到0.99674。

图2 血红蛋白浓度与吸光度浓度标准曲线

1.2.4 数据计算和分析

报告每台血泵的NIH平均值、标准偏差及变异系数。

式中： NIH表示标准溶血指数，单位为克每100 L（g/100L）；△free Hb指在采样时间间隔内，血浆游离血红蛋白浓度的增加量（g/L）；V指回路容量，单位为升（L）；Q为流量，单位为升每分钟（L/min）；Hct为红细胞压积，单位为百分比（%）；T为采样时间间隔，单位为分钟（min）。

2 讨论

2.1 溶血限值的讨论

不难设想，如果一个外来因素（例如心室辅助装置）对红细胞造成的破坏程度和速度不超过自然衰亡，那么可以认为该装置是安全可行的。因此，生物体对游离血红蛋白的耐受度一直受到学者的关注。从公式(1)来看，标准溶血指数的定义其实质就是在单位时间内，通过单位横截面积所破坏的红细胞的质量。由于人体自身的骨髓具有造血功能，红细胞会自然衰亡并不断更新，大约3个月左右，血液中的红细胞将全部更新一次。因此，我们可以大概估算下溶血指数的最大允许值（Haemolytic Index，HI）。设一个正常成人的红细胞在血液中的密度是14 g/100mL[12]，人体的血液的平均流量为5 L/min，总体积为5 L。则

因此，溶血指数的极限值为0.1 g/dL。对任何一种心室辅助装置而言，若想临床应用，给予一定得冗余值，一般为最大值的十分之一左右，因此，要求其溶血指标必须保证不得高于0.01 g/dL。

2.2 入组血液质量要求

血泵引起的溶血主要取决于血泵的设计、结构和所使用的材料。用于体外评价血液破坏的血源在很大程度上将会影响血泵性能评价的结果。体外溶血试验的试验结果很大程度上会受到供血者物种、血液的生化状态（碱剩余、葡萄糖）、血红蛋白及红细胞压积等因素的影响。因此，用于体外评价血泵溶血性能的血液进行标准化是非常重要的，而且这将会使试验结果具有普遍的可比性。

2.2.1 供血者物种的考虑

一般来说，供血物种包括牛、羊和猪等大动物以及志愿者的血液。Harboe[16]评估了剪切应力对牛、绵羊和猪血液中的细胞和蛋白质的影响。并使用流变仪对来自不同物种的血液进行各种剪切速率0～8000 s分析。总体而言，增加剪切速率会使所有测试物种血液的血创伤增加。不同物种之间血液的破坏主要体现在溶血、血小板激活以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）的结构和功能。与人血相比，在剪切力作用下，猪血具有最大的弹性、较少程度的溶血、相似的血细胞数量、较少的血小板激活以及较少的vWF损伤；牛血具有较少的溶血、相似的血细胞数量、较高的血细胞激活以及相似的vWF损伤，对于剪切力总体体现出较少的影响；绵羊血具有最小的弹性。牛血与人血最为相似，因此文献建议用牛血来评估体外的溶血测试。

2.2.2 血液的生化状态的考虑

为确保测试结果的准确性，游离血红蛋白浓度超过20 mg/dL的待测血液将不被采用。测试用血液的血细胞比容应在28%～32%范围内。另外血液的其它指标如pH值、血糖等参数应在正常值范围内。血液的过酸或过碱都会导致血液的破坏。而另一方面，根据渗透学原理，当外界的葡萄糖浓度过低时，葡萄糖溶液中的水分子开始扩散进入红细胞，最终使红细胞吸水膨胀至破裂，因而产生溶血现象。因此在体外测试溶血前，一般建议BE（碱剩余）调节在（0±5）nmol/L、葡萄糖浓度应大于90 mg/dL。

2.3 游离血红蛋白检验方法的讨论

测定血液中游离血红蛋白浓度的方法有很多[15]，有物理测定方法，包括比重法、折射率法等，也可由根据血红蛋白的化学结合力，如血红蛋白可与O2和CO结合生成HBO2和HBCO，与氰化物结合生成氰化高铁血红蛋白，再根据衍生物的光谱特性进行测定。由于测量方法较多，导致实验室间的检测结果缺乏可比性。针对这种情况，国际血液学标准化委员会成立了血红蛋白专家组,该专家组于1967年在测定了氰化高铁血红蛋白摩尔吸光系数的基础上，确定了以氰化高铁血红蛋白法为血红蛋白测试的参考方法。但使用的氰化钾试剂含有剧毒物质，对使用者及环境有一定的危害，谨慎考虑，我们采用了碳酸钠测试方法对游离血红蛋白浓度进行测试[15-16]。总体来说，碳酸钠的化学性质相对稳定，且无毒无生物危险，水溶液呈碱性，能与血红蛋白迅速结合形成红色碱化血红蛋白。因此，实际检测中，采用碳酸钠血红蛋白测试法，能大量减少医疗废弃物，很大程度上弥补氰化高铁血红蛋白法的不足，但为了保证试验结果的准确性，建议使用全血质控品或与氰化高铁血法同时检测进行校正。

3 结论

溶血特性是衡量VAD对血液成分和理化性质影响的重要指标。通过溶血测试，评价血泵的溶血性能，对于保证血泵的有效性和安全性具有重要意义。溶血指数NIH的物理意义是反映输出100 L压积标准化血液产生的FHB含量，是目前世界上公认的体外评价血泵溶血性能的金标准。血泵设计厂商有必要使用具有良好血液相容性的血泵材料，并优化加工工艺，使血泵具有良好的热传导性能和较低的机械产热。设计时引入计算流体力学分析，优化结构设计，详细分析泵体内部流场和剪切应力分布，减少于溶血密切相关的高剪切力和振荡剪切力分布区域，减少血液接触面积。本文采用ASTM F1841-97标准，搭建了检测平台，进行了溶血指数测量，明晰了实现方法和细节，希望供研发和评价人员借鉴。

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