不同产地猫爪草中粗多糖和多糖含量的比较研究

王海燕，梁利香

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳 464000)

猫爪草为毛茛科植物小毛茛Radix Ranunculi Ternati.的干燥块根，收载于《中国药典》2015年版(一部)。猫爪草原为无名野草，药用历史较短，是上世纪50年代于河南省信阳地区发现的一种草药，后经信阳中医院依据其根形及能治疗鼠疮的特点定名为“猫爪草”。对其药理历代本草均无记载，民间主要用于治疗颈淋巴结核(俗称老鼠疮)、腮腺炎(俗称痄腮)。文字记载则首见于《中药材手册》，1977年《中华人民共和国药典》开始收载，《中国药用植物志》《广西中药志》《河南中草药手册》《湖北植物志》等也有记载。猫爪草主产于河南信阳地区的淮滨、息县及驻马店地区的正阳、确山；另外，我国长江中、下游 (包括浙江、江苏、安徽、江西、广西、河南、湖北、湖南、四川、云南、贵州等省) 以及台湾地区均有分布， 在日本本州、四国、九州也有分布[1-2]。功能化痰散结，解毒消肿，用于瘰疬痰核，疔疮肿毒，蛇虫咬伤[3]。猫爪草是河南省的一大宗药材，同时被列为国家药品监督管理局重点发展的63种紧缺中药材之一，是国家重点发展的三类中药材之一。现在临床用于治疗淋巴结结核、淋巴结炎、肺结核、咽炎、淋巴瘤、甲状腺瘤、乳腺肿瘤、肺癌等疾病[4-5]。猫爪草近年来由于其抗肿瘤活性备受人们的关注，诸多实验研究表明猫爪草多糖(PRT)是其抗肿瘤、抗氧化、保肝、调节免疫的活性成分[6-11]。本实验对不同产地猫爪草中粗多糖和多糖的含量进行对比研究，为河南产猫爪草的道地性、资源开发和质量控制提供实验依据。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料与试剂

猫爪草分别产自河南信阳地区的淮滨和息县、河南驻马店地区的正阳和确山、湖北、江苏、安徽、浙江、江西、广西、湖南、四川、云南、贵州等地，由信阳农林学院中药教研室鉴定为毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，药材来源见表1。无水葡萄糖标准品(中国计量科学研究院，批号为GBW1006213001,含量为99%)；酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、无水硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、乙醇等均为分析纯，纯化水自制。

1.2 仪器

751G型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；SHB-3型循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)；水循环恒温水浴箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；AB-135-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器制造有限公司)；SCQ-8201E超声清洗仪(上海声彦超声波仪器设备有限公司)。

表1 药材来源

1.3 药材处理

将猫爪草挑练、淘洗后，105℃烘干，粉碎成60目，备用。

2 实验方法

2.1 DNS试剂配制

称取酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热(50℃以下)，于热溶液中依次加入2.1g氢氧化钠、0.63g 3,5-二硝基水杨酸、苯酚0.5g和无水亚硫酸钠0.5g，超声(45～50℃)至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，棕色瓶储存备用。

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制 精密称定105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品59.1mg于50ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得葡萄糖对照品溶液。

2.2.2 标准曲线的制备 精密移取上述葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL于6只25 mL容量瓶中，加水至1mL，加DNS试剂3mL，沸水浴加热15min，迅速冷却至室温，加水稀释至刻度。按照紫外-可见分光光度法[12]，在550nm处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.013385C-0.03355(r=0.9992)，结果表明葡萄糖在9.456～47.28μg/mL范围内线性良好。结果见表2和图1。

图1葡萄糖标准曲线

表2 葡萄糖标准溶液吸收度测定结果

2.3 猫爪草中粗多糖和多糖的含量测定

2.3.1粗多糖的制备及收率测定 取各产地猫爪草药材粉末(60目)各3份，每份100g，加药材量0.2%的α-淀粉酶和3倍量水进行酶解，酶解温度 50℃，酶解pH值为 6 ，酶解时间30min；再加7倍量水超声提取20min，超声功率为300W；抽滤，滤渣再加水超声提取2次，每次加水10倍量，提取20min，合并3次α-淀粉酶协同超声提取法提取所得水提液，浓缩至约100mL(每mL药液相当于1g药材)，冷却至室温，加乙醇至乙醇含量70%，置冰箱中冷藏过夜，抽滤，60℃干燥，即得。称量、计算粗多糖收率，结果见表3。

2.3.2 多糖溶液的制备及测定 称取猫爪草粗多糖约30mg，置25ml容量瓶中，加水5mL，加6mol/L盐酸6mL，超声溶解，置90℃烘箱中，加热30min，取出冷却至室温，加6mol/L氢氧化钠溶液至溶液呈中性，加水至刻度，过滤，取续滤液2 mL置25 mL容量瓶中，加DNS试剂3mL，沸水浴加热15min，迅速冷却至室温，加水稀释至刻度，550nm处测定吸光度，计算粗多糖中多糖的含量，结果见表3。用Excel中单因素方差分析对14个产地和河南省4个产地猫爪草中粗多糖含量(%)和多糖含量(%)进行统计分析，并对不同产地粗多糖和多糖含量的相关性进行显著性检验，结果见表4-8。

表3 不同产地猫爪草中粗多糖和多糖含量(n=3)

表4 14个产地粗多糖含量的显著性差异方差分析表

表5 14个产地多糖含量的显著性差异方差分析表

表6 4个产地粗多糖含量的显著性差异方差分析表

表7 4个产地多糖含量的显著性差异方差分析表

表8 粗多糖和多糖含量相关性检验

3 结论与讨论

试验结果表明，不同产地猫爪草中粗多糖和多糖的含量有极显著差异。14个产地粗多糖含量(%)F值为135.3905(p《0.01)，多糖含量(%)F值为151.7603(p《0.01),以河南信阳淮滨产猫爪草中总糖和多糖的含量最高；但河南四个产地(1-4号)产的猫爪草中粗多糖和多糖的含量无明显差异，粗多糖含量F值为3.628(p=0.06>0.05)，多糖含量F值为2.63(p=0.122>0.05)。即本试验结果表明：在被考察产地中以河南信阳猫爪草中粗多糖和多糖含量最高，且与其它产地有显著性差异，猫爪草中粗多糖和多糖含量具有显著相关性。猫爪草的采收季节为春季和秋季，本试验研究结果表明不同产地猫爪草中粗多糖和多糖的含量差异明显，原因或许是地域差异也或许是季节差异所致或与地域、采收季节均有关系，有待进一步研究。

多糖的测定方法有多种，目前国内测定中药材中多糖含量的方法以比色法为主，包括咔唑一硫酸、蒽酮一硫酸 、苯酚-硫酸、3 ，5-二硝基水杨酸、邻甲苯胺法等。较常用的是苯酚-硫酸法和蒽酮一硫酸法，其原理均是己糖在硫酸作用下，分子内脱水生成糠醛可与之缩合成有色配合物，可在可见波长区有最大吸收。但因苯酚-硫酸法中所用苯酚试剂需蒸馏后方可使用，且污染较大；蒽酮-硫酸法，操作繁琐，显色时间、温度、操作的快慢等都会对测定结果有不同程度的影响。本实验采用水解后以DNS试剂显色，实验表明线性良好，显色稳定，重现性好，操作简单，适用于猫爪草中多糖的比色测定。