重组杆状病毒感染悬浮昆虫细胞及重组蛋白表达策略的优化

李文丽，刘 霞*，刘在新，卢曾军，范朋举

(1. 甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector systems，BEVS)是基因工程四大表达系统之一，是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体、以昆虫或昆虫细胞(Sf-9)为受体的表达系统。昆虫杆状病毒表达系统具有操作简便、能对蛋白质进行翻译后修饰加工、克隆容量大、生物安全性好、可同时表达多个外源基因等优点[1-2]。昆虫杆状病毒有多种表达载体系统，包括经典的体内重组策略、线性化杆状病毒[3]、Bac-to-Bac系统等，其中应用Bac-to-Bac系统获得重组病毒的方法是直接从细菌中获得。重组杆状病毒还可以进入某些哺乳动物的细胞系[4]，为基因治疗提供可能。除此之外，基于杆状病毒的宿主特异性，昆虫杆状病毒表达系统还可应用于生物防治[5]。

目前，BEVS较为广泛地应用于生物制药、生物医学、农业生产，例如生产VLPs疫苗[6]、生产重组蛋白[7]等。所得到的重组蛋白可以作为刺激哺乳动物免疫系统的免疫原，应用于单克隆抗体的生产[8]。Martinez等[9]采用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了PPV-VP2蛋白，电镜观察表达的VP2蛋白可以自行组装成VLPs，动物试验显示其具有良好的免疫效果。范朋举[10]通过电镜观察证明，嵌合FMDV中和表位的PPV-VLPs可以组装产生类似于PPV自然病毒粒子的VLPs结构，但并未对嵌合蛋白L2S在悬浮Sf-9细胞中大量表达的最佳条件进行深入研究。本研究将在此基础上利用杆状病毒表达系统大量表达嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的衣壳蛋白，探究其表达的最佳条件，以期获得大量具有生物学活性的嵌合蛋白L2S，为研发具有同时抗FMDV和PPV双重免疫效果的表位嵌合疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

嵌合FMDV中和表位PPV的P1代重组病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。病毒DNA提取试剂盒、RNase-Free ddH2O、TaKaRa病毒滴定试剂盒、DL12000 DNA Marker、Sf-9细胞、昆虫细胞培养基SFM 900Ⅲ均购自宝生物工程(大连)有限公司；细胞裂解液RIPA、ECL工作液均购自北京百泰克生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 Sf-9细胞培养

1.2.1.1 贴壁培养Sf-9细胞 将细胞从液氮中快速取出在37 ℃水中迅速溶解，在细胞瓶中加入SFM 900Ⅲ培养基6 mL，取Sf-9细胞1 mL轻轻吹打混匀后加入培养基中，放至28 ℃温箱，无CO2条件下培养12～24 h，定时更换新的培养基，每天观察细胞，待细胞长满后传代。

1.2.1.2 悬浮培养Sf-9细胞 将贴壁细胞轻轻拍打下来，然后计数，以初始密度为3×104～5×104个/mL接种量接种到30 mL带有透气塞子的三角瓶中，放到恒温摇床上，无CO2、28 ℃、130 r/min条件下培养，每隔24 h进行细胞计数，绘制悬浮培养的Sf-9细胞的生长曲线。

1.2.2 重组病毒感染Sf-9细胞 将P1代重组病毒离心，取上清，按0.01个感染复数(MOI)病毒液感染贴壁Sf-9细胞，1 h后加入新的培养基SFM 900Ⅲ，每天观察细胞病变情况，直到完全病变后收集细胞，在-70 ℃冰箱反复冻融3次后于4 ℃冰箱保存，直到获得高滴度的P3代重组病毒[11-12]。

1.2.3 杆状病毒滴定试剂盒测定病毒滴度 收获P3代重组病毒，提取病毒DNA，进行qPCR试验。用EASY稀释缓冲液稀释标准DNA，将其进行10-7、10-6、10-5、10-4倍稀释。按以下加到96孔板中，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，荧光染料0.4 μL，qPCR混合物10 μL，PCR-Grade H2O 6.8 μL，标准病毒DNA 2 μL。分析荧光定量数据，绘制标准曲线，根据复制拷贝数，计算出病毒滴度。

1.2.4 重组病毒PCR鉴定 为确保目的基因不因传代而丢失，P3代重组病毒感染细胞前要进行PCR鉴定。用病毒DNA试剂盒提取重组杆状病毒DNA[13]，取200 μL重组杆状病毒P3代毒株，加入到1.5 mL离心管中，然后加入200 μL Buffer AL和25 μL蛋白酶，剧烈振荡混匀，56 ℃恒温放置15 min；加入250 μL乙醇，反复颠倒混合均匀，振荡15 s，室温静置5 min；将试剂盒中的收集柱安装到新的收集管中，将上一步混合好的液体加入收集柱中8 000 r/min，离心1 min，弃废液，更换新的收集管；加入500 μL Buffer AW1到收集柱中，8 000 r/min离心1 min，弃废液，更换新的收集管；加入500 μL Buffer AW2到收集柱中，8 000 r/min离心1 min，弃废液，更换新的收集管；加入500 μL乙醇到收集柱中，8 000 r/min离心1 min，弃废液，更换新的收集管；14 000 r/min 离心1 min，快速干燥；56 ℃恒温放置3 min，彻底干燥；将收集柱安装到新的1.5 mL离心管上，在收集柱的膜中央加入50 μL的RNase free H2O，室温静置5 min；14 000 r/min离心1 min洗脱，洗脱的液体即为重组病毒DNA。

以M13-F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13-R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′为扩增引物，DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 重组病毒最佳增值条件的优化 分别以0.01、0.05、0.1个MOI转染对数期悬浮Sf-9细胞，连续培养96 h后每24 h收集少量细胞[12]，-70 ℃冰箱反复冻融3次，离心取上清，用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，然后用病毒滴定试剂盒测定病毒复制的拷贝数，选出最佳MOI和感染时间，从而大量感染悬浮Sf-9细胞获得高滴度的病毒。

1.2.6 重组蛋白L2S的表达与检测

1.2.6.1 重组蛋白L2S表达条件的优化 以0.5、1、5、10个MOI病毒液分别感染悬浮Sf-9细胞，连续培养24～96 h，每24 h收集少量细胞沉淀，用细胞裂解液冰上裂解30～60 min，离心取上清加4×蛋白质上样Buffer处理， Western blot分析筛选出最佳的重组蛋白表达条件[13]。

1.2.6.2 重组蛋白L2S的表达 SDS-PAGE电泳：12%的SDS-PAGE电泳凝胶，取处理好的蛋白质样品15 μL加入对应的电泳凝胶孔内，标准蛋白质Marker 10 μL，140 V电泳1 h。转膜：SDS-PAGE电泳后的凝胶切去多余部分，取在甲醇溶液中浸泡活化的后聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和1层厚滤纸，按照负极板、1层厚滤纸、胶、PVDF膜、1层厚滤纸的顺序排列整齐，确保各层之间没有气泡，盖上正极板，于160 mA恒流下转膜1 h。封闭：将转印好的PVDF膜取下，放入含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭液中，4 ℃过夜。一抗孵育：用含50 g/L 脱脂奶粉的TBST溶液按1∶2 000稀释PPV兔抗血清和O型FMDV兔抗血清，后将封闭好的PVDF膜置于其中，37 ℃轻摇孵育2 h，孵育结束后用TBST 漂洗1～4 次，每次6 min。二抗孵育：将羊抗兔和兔抗猪IgG-HRP分别用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液按进1∶4 000稀释，后将漂洗好的PVDF膜置于其中，37 ℃轻摇孵育1 h，孵育结束后用TBST漂洗5～6次，每次10 min。底物显色：将PVDF膜转移到10 mL的DAB底物显色液中避光反应30 s，条带出现后，立即取出PVDF膜放入清水中漂洗，拍照保存结果。蛋白质检测：将PVDF膜放置暗盒中，加入ECL工作液显色曝光[14]。

2 结果与分析

2.1 Sf-9细胞形态学特征

图1A所示，贴壁Sf-9细胞边缘不整齐，大小不均一，有的呈椭圆型，细胞结团比较严重，还有些死细胞；图1B所示，悬浮Sf-9细胞比贴壁Sf-9细胞形态好，边缘整齐，大小均一，呈圆形，结团现象不太明显。对比得出,Sf-9细胞更适合悬浮培养。

A：贴壁Sf-9细胞；B：悬浮Sf-9细胞

2.2 悬浮Sf-9细胞的生长曲线

随着细胞在含血清培养基中不断适应和传代，血清对细胞活性的改善不明显，故选择无血清培养Sf-9细胞[15]。Sf-9细胞以初始密度为3×105个/mL的接种量接种，连续培养8 d，每隔1 d进行细胞计数，绘制生长曲线。由图2可知，在第7天细胞密度达到最大值，第8天后细胞数下降，试验选择4～5 d处于生长对数期的细胞[16]。

图2 悬浮Sf-9细胞生长曲线

2.3 重组病毒的扩增

用P1代重组病毒L2S感染对数期Sf-9细胞，连续观察细胞形态。当出现细胞生长停滞，细胞直径变大，细胞核体积增大，细胞具有颗粒状外观，部分细胞脱落、裂解等现象时(图3)，收集细胞，持续感染得到P3代重组病毒。

A：正常状态下的Sf-9细胞；B：转染重组病毒72 h的Sf-9细胞

2.4 重组病毒PCR鉴定结果

将P1代重组病毒扩增到P3代，用病毒DNA试剂盒提取杆状病毒基因DNA，以M13为扩增引物进行PCR鉴定，检测插入目的基因的完整性。经PCR鉴定显示，重组病毒大小为4 374 bp，与重组杆粒 PCR鉴定结果一致[10]，如图4所示，表明插入的目的基因完整，可以大量感染Sf-9细胞以进行重组蛋白L2S的表达。

在P3代毒株感染Sf-9细胞表达蛋白质之前，进行P3代毒株病毒滴度检测，本试验采用病毒滴定试剂盒测定P3代毒株的病毒滴度。经过病毒滴定试剂盒测定的重组病毒拷贝数换算成病毒滴度为6.3×106pfu/mL。

M：DL12000 DNA Marker；1—4：重组病毒

2.5 重组病毒增殖条件优化结果

通过用不同MOI感染病毒来研究病毒复制最佳条件，结果如图5所示，重组病毒在0.05个MOI、72 h时收获病毒病毒的复制拷贝数达到最高，为2.3×106拷贝/mL，故选择在此条件下感染悬浮Sf-9细胞以获得大量高滴度重组病毒，为后续重组蛋白L2S最佳表达条件的优化做准备。

A：感染MOI=0.01的悬浮Sf-9细胞；B：感染MOI=0.05的悬浮Sf-9细胞；C：感染MOI=0.1的悬浮Sf-9细胞

2.6 重组蛋白L2S表达与最佳表达条件筛选结果

将优化重组病毒增殖条件后获得的大量高滴度病毒液分别以0.5、1、5、10个MOI感染悬浮Sf-9细胞[17]，连续培养96 h，每24 h离心收集细胞，用细胞裂解液RIPA裂解细胞，离心后取上清用于SDS-PAGE凝胶电泳，并于转膜后加PPV兔抗血清孵育，再加山羊抗兔酶标二抗进行孵育，如图6所示，DAB显色后在膜上出现特异性67 ku条带。进一步用Western blot验证插入的FMDV中和表位的存在，首先用O型FMDV猪抗血清作为一抗孵育，再加兔抗猪酶标二抗孵育，如图7所示，DAB显色后在膜上也出现特异性67 ku左右的条带。将放射自显影图片用Image J软件计算出灰度值，通过灰度值大小对比得出，重组蛋白L2S在10个MOI、72 h感染条件下重组蛋白L2S表达量最大，即为重组蛋白L2S最佳表达条件。在此最佳表达条件下大量感染悬浮Sf-9细胞，以获得大量重组蛋白L2S，可为后续动物试验做准备。

图6 O型FMDV猪抗血清检测重组蛋白表达

图7 PPV兔抗血清检测重组蛋白的表达

3 结论与讨论

昆虫细胞培养基SFM 900Ⅲ具有细胞密度高、培养基成分明确、易于大规模悬浮培养等优点[18]。张宝珠[19]研究发现，Sf-9细胞在低血清甚至无血清培养基中生长良好。李伟等[20]对Sf-9昆虫细胞在不同培养基、培养基中是否添加血清及不同生物反应器中的培养工艺进行研究发现，Sf-9细胞在SFM 900Ⅲ无血清培养基中生长比在添加10%小牛血清的Grace培养基中更好。本研究在无血清培养基SFM 900Ⅲ的培养条件下进行，发现Sf-9细胞生长状态良好。

本研究通过对比贴壁培养和悬浮培养2种培养条件，得出在悬浮培养状态下细胞形态更好。王晓迟等[16]通过研究不同初始接种密度对Sf-9细胞生长的影响，得出104个/mL数量级是其生长的临界接种密度。本研究以104个/mL接种剂量下接种细胞，细胞倍速递增，生长状态良好。绘制Sf-9细胞生长曲线，确定细胞的对数期，为后续病毒复制条件优化的研究提供大量对数期供试细胞。

大量高滴度病毒的制备是探索重组蛋白最佳表达条件的前提，因此进行病毒复制条件的优化至关重要。张佑红等[21]在摇瓶中利用正交试验探讨了MOI、感染时间(TOI)、细胞初始浓度(ICD)的相互关系以及对病毒产量的影响，得出MOI对病毒产量的影响最大，ICD次之，TOI影响最小。本研究以不同MOI感染Sf-9细胞，发现以0.05个MOI感染72 h的条件下病毒产量最大。推测低MOI感染时，少量细胞被感染，大部分细胞继续生长，当细胞自溶后释放出病毒再次吸附感染细胞，但此时正常生长的细胞与被释放的病毒再次吸附感染的细胞竞争性消耗培养基中营养物质，所以不利于病毒的再次扩增；高MOI感染时，大量病毒导致细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死，所以病毒的扩增产量也很低。

为了获得大量的重组蛋白，本研究以不同的MOI感染Sf-9细胞来研究重组蛋白L2S最佳表达条件。曹轶梅等[22]用10个MOI重组病毒Bac mP12A3C感染Sf-9细胞，在24、48、72、96、120 h收集蛋白质，后用双抗体夹心ELISA检测目的蛋白,发现重组病毒感染48 h时就能检测出目的蛋白，而目的蛋白的最佳表达条件是10个MOI，感染96 h。本研究发现，在48 h时能够检测到重组蛋白L2S，但是重组蛋白L2S在10个MOI，感染72 h时表达量达到最大。