血小板GPⅡb/Ⅲa基因多态性与EDTA依赖性假性血小板减少症的相关性研究

张伟红 徐邦牢 杨惠宽 陈 斌 张 婷 吴 斌 唐露丹 胡晓琳

EDTA 依赖性血小板假性减少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia, EDP)是指在健康群体和各种病人由于抗血小板自身抗体在EDTA 存在条件下引起血小板聚集，在全自动血球计数仪检测时血小板计数发生假性减少的现象。由于全自动血球分析仪很难对这些聚集血小板进行分类鉴别，仪器只对此进行提示报警，如巨大血小板、大血小板或血小板聚集，此类患者即使用世界卫生组织推荐的草酸铵稀释液血小板人工计数方法，在显微镜下用血细胞计数板人工计数血小板数也会假性减少，存在较大的隐蔽性，使病人再做不必要的检查项目，易造成误诊误治[1-3]，已引起临床广泛关注。人类血小板抗原(Human platelet alloantigen，HPA)是血小板膜糖蛋白上的抗原表型，是血小板特有的抗原决定簇，目前已鉴定出24个HPA抗原其中23个HPA抗原基因多态性的分子生物学基础已阐明[4]。血小板膜糖蛋白在血小板粘附、活化、聚集和血栓形成过程中发挥着关键作用。其中导致血小板聚集的因素均依赖血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化，活化的GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合是血小板聚集的最后通路。有学者对原发免疫性血小板减少症患者GPⅡb/Ⅲa 抗体水平进行了并探讨[5]，也有学者对血小板膜糖蛋白基因多态性与冠心病关联进行研究[6]。EDTA 依赖性血小板假性减少的发生机制研究已取得一定进展，主要集中在相关的免疫球蛋白方面的研究，在基因多态性方面研究较少，本课题在群体水平分析健康人和EDTA 依赖性血小板假性减少患者GP Ⅱb/Ⅲa 基因多态性，探讨其与EDTA 依赖性血小板假性减少发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

分别收集2016年10月-2017年10月住院部近三个月无输血史确诊为EDTA依赖性假性血小板减少症(EDP)患者29例为实验组，其中男16例，女13例，年龄12～60岁，平均年龄41.0岁。收集无血小板减少、血小板聚集病史健康体检人群21例为对照组，其中男12例，女9例，年龄12～50岁，平均年龄35.0岁。

1.2 试验方法

1.2.1 标本 抽取静脉血于EDTA-K2抗凝半小时内在全自动血球分析仪进行血小板数的检测并做人工推片观察血小板分布情况，检测完EDTA-K2抗凝血置于冰箱2～8℃保存送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因多态性分析。

1.2.2 仪器试剂 XE-5000全自动血球分析仪、ABI PCR仪、计量检测仪器有限公司HS-800D数显恒温水浴锅、Syngene凝胶成像仪、ABI测序仪等。XE-5000全自动血球分析仪试剂和质控均为原厂试剂，引物、PfuDNA Polymerase 高温聚合酶、PCR产物纯化回收试剂盒和DNA提取试剂盒等均为生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3 结果分析

1.3.1 引物序列

HPA抗原系统HPA等位基因GP膜糖蛋白 上下游引物HPA-3HPA-aHPA-bGPⅡbrs5911-F5' GAGCCTGCTCACTACGAGAACTG 3' 61rs5911-R5' AGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAA 3' 61.5 383-638=256HPA-6HPA-aHPA-bGPⅢars13306487-F5' GGCAATGGGACCTTTGAGTGT 3' 61.2rs13306487-R5' CTATGTTTCCAGTGGTTGCAGGTAT 3' 61.8 136-470=335

1.3.2 PCR反应体系：25 μL体系的配制: 模板1 μL, 引物Fi 0.5 μl, 引物Ri0.5 μl, dNTP 10 mM 0.5 μl, Taq Buffer 2.5 μl, Taq酶(5 U/μl)0.2 μl,水20 μl。

1.3.3 PCR反应条件 进行 PCR 扩增，程序如下：在95 ℃下进行预变性 3 min，然后在 94 ℃下进行变性 30 s，在 58 ℃ 30 s进行退火处理，在72 ℃下延伸持续 30～60 s，循环数35个。修复延伸72 ℃ 10 min。

1.3.4 1.5%TAE琼脂糖电泳 150 V、100 mA 20 min电泳观察(见电泳图)

1.3.5 测序 用双脱氧链终止法分别检测实验组与对照组的GPⅡb HPA-3和GPⅢa HPA-6基因多态性。

Marker 前四个为GPⅡb基因引物随机取样，后四个为GPⅢa基因引物随机取样

1.4 统计方法

2 结果

2.1 实验组与对照组GPⅡbHPA-3 (rs5911)不同基因型结果比较

2.2 实验组与对照组GPⅢa HPA-6(rs13306487)和其下一位点基因型结果比较

2.3 GPⅢa HPA-6 rs13306487位点后一位杂合基因型A/G在实验组与对照组结果比较

3 讨论

血小板膜糖蛋白覆盖于血小板质膜表面上，在血小板活化和血栓的形成中发挥重要作用[7‐8]。目前已发现血小板膜糖蛋白的5种血小板膜受体，血小板膜糖蛋白与受体在一定条件下形成复合体从而调节血小板性血栓的形成，其中GP Ⅱb HPA-3和GP Ⅲa HPA-6基因具有关键作用。至今EDTA依赖性假性血小板减少症发生机制并未明确，有报道认为EDTA依赖性假性血小板减少症患者体内存在抗血小板自身抗体是免疫球蛋白家族IgM 、IgG或IgA，这些免疫球蛋白直接针对隐藏的抗原决定簇，而这些抗原决定簇平时隐藏在血小板膜糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa 人凝血因子IX中，由于GP Ⅱb/Ⅲa需要Ca2+存在下保持其异二聚体结构，EDTA可以通过它与Ca2+的螯合作用分离GP Ⅱb/Ⅲa，导致GP IIb表簇的暴露[9-11]。但亦有报道证实在健康群体和各种不同疾病的病人身上都存在这些抗血小板自身抗体却没发生EDTA依赖性假性血小板减少症[12]。已有文献报道对EDTA依赖性假性血小板减少症血小板的CD41、CD61、CD62p、PAC-1 等活化指标为研究基础，对EDTA依赖性假性血小板减少症发生机制作了初步探讨[13]。许多报道证实血小板膜糖蛋白多态性与血栓性疾病的具相关性[14-16]，但对其与EDTA 依赖性血小板假性减少症的探讨还未明确。EDP发生机制研究已取得一定进展，主要集中在相关的免疫球蛋白方面的研究，但在基因水平的研究较少，为了获得进一步研究，应用分子生物学技术，探讨GPⅡb/Ⅲa基因多态性与EDTA 依赖性血小板假性减少症的相关性关系。为进一步阐明EDP 患者血小板聚集的遗传机制，可更好的为临床准确诊断具有重要的临床意义。

表1实验组与对照组GPⅡbHPA-3基因型例数和百分比n(%)

基因型 A/AA/CC/C2P组别实验组对照组9(31.0)14(48.3)6(20.7)3(14.3)11(52.4)7(33.3)2.2140.331

表2 实验组与对照组GPⅢa HPA-6基因型百分比n(%)

表3 实验组与对照组GPⅢa HPA-6基因后一位点基因型百分比 n(%)

表4 实验组与对照组GPⅢa HPA-6基因下一位点杂合型与纯合型百分比 n(%)

GPⅡb 和GPⅢa 基因均定位于染色体17q21—22，GPⅡb基因位于GPⅢa 基因的3′端，基因转录起点位于上游184～213 kb 区域。两者相距不足260 kb。GPⅡb 基因含有29 个内含子和30 个外显子，基因全长约17.2 kb[17]。编码GPⅡb/Ⅲa的基因具有高度多态性的特点。血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa 基因可由于突变、缺失或插入导致表型改变，导致血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa结构和表达水平发生变化，进而影响血小板的黏附、聚集作用。目前已确认常见抗原编码的GP Ⅱb/Ⅲa 基因，如GP Ⅲa(HPA-1，-4，-6,-7，-8，-10)和GP Ⅱb(HPA-3，-9)。GP Ⅲa基因多态性最常见的是2号外显子的T1565C，还包括C157T、G1846T、C1267G、G1996A、A1163C、C2004T、C12569T等。GP IIb基因多态性主要有HPA3a/3b，其他的多态性位点还包括MAX-/MAX+、GP IIb G1063A等。本研究对GPⅡb HPA-3和GPⅢa HPA-6基因多态性与EDTA 依赖性血小板假性减少症的相关性进行了探讨。研究发现GPⅡbHPA-3基因多态性在实验组中A/A、A/C和C/C基因型频率分别是31.0%、48.3% 和20.7%，对照组基因型频率分别是14.3%、52.4%和 33.3%，两组之间基因多态性频率无显著差异P>0.05。GPⅢa HPA-6基因多态性在实验组中C/C和G/G基因型频率分别是6.9%和93.1%，对照组基因型频率分别是19.0%和81.0%，两组之间基因多态性分布无显著差异P>0.05。GPⅢa HPA-6基因rs13306487位点后一位基因多态性在实验组中A/A、A/G和G/G基因型频率分别是3.4%、55.2% 和41.4%，对照组基因型频率分别是14.3%、23.8% 和61.9%，两组之间基因多态性分布无显著差异P>0.05。尚不能得出膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa HPA-3和 HPA-6多态位点与EDTA 依赖性血小板假性减少症之间存在相关性。但在GPⅢa HPA-6rs13306487位点后一位纯合子基因型(A/A和 G/G)与杂合子基因型A/G频率分别是44.8%和55.2%，对照组分别是76.2%和23.8%，杂合基因型A/G在实验组与对照组之间分布频率存在统计学差异(P=0.027，P<0.05)，可初步推断GPⅢa HPA-6位点后一位杂合基因型A/G与EDTA 依赖性血小板假性减少症之间存在一定的相关性。也为后续研究EDTA 依赖性血小板假性减少症聚集血小板解离奠定基础。进一步可有效避免误诊、误治和医疗纠纷，使检验工作在解决血小板假性减少问题方面有新的突破。由于本研究标本量比较小，相关研究结论仍需进一步的大标本研究证实。