七叶皂苷钠通过CARMA3/NF-κB信号通路抑制肝癌细胞的增殖

李未祥，周大臣，王 石，崔 笑，侯 辉，耿小平

(安徽医科大学第二附属医院肝胆外科，安徽 合肥 230601)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]，对于HCC的治疗，目前仍首选手术，但分子靶向治疗逐渐成为热点。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 是一种核转录因子，在细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种自身免疫疾病的调节中起至关重要的作用，文献报道其在肝癌发生、发展中也起重要作用[2-4]。Caspase募集域和膜相关鸟苷酸激酶样结构域蛋白3(CARD recruited membrane associated protein 3，CARMA3)蛋白是NF-κB上游调节因子[5-7]。七叶皂苷钠(sodium aescinate, SA)是一种天然植物提取物，于2006年2月被中国食品药品监督管理局(CFDA)批准为临床用药，主要用于抗氧化、抗炎和保护血管损伤，相关研究证实七叶皂苷钠能防止炎症引起的肝损伤[8]。且NF-κB信号通路与氧化和炎症相关[9]，所以我们假设，通过干扰CARMA3/NF-κB信号通路，七叶皂苷钠可能有效抑制HCC的增殖。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1患者和标本 本研究已获得安徽医科大学第一及第二附属医院伦理委员会批准。从我们的HCC组织库中选取2000～2015年期间100例HCC患者的原发性肝癌肿瘤组织和相邻肝组织。术前抗肿瘤治疗或由CT、MRI或PET证实肝外转移的患者被排除在本研究之外。所有患者均接受R0肝切除术。通过Edmondson分级系统表征分化和肿瘤分级。年龄、性别、肝硬化、肿瘤直径、微血管浸润、肿瘤分化情况等见Tab 1。每3个月进行1次随访，血清AFP、肝功能检查、HBV-DNA和肝脏超声检查结果均记录在案。随访的最后期限为2017年6月30日。总生存时间是从首次手术到患者死亡日期或最后一次随访测量的。

1.1.2试剂 七叶皂苷钠 (中国武汉化工生物化学股份有限公司,纯度98%)；超敏二步法免疫组化检测试剂盒(pv9001,北京中杉金桥公司)；兔抗CARMA3多克隆抗体(ab36839，美国Abcam公司)；兔抗NF-κB(p65)单克隆抗体(D14E12，美国CST公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (美国Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:556547, 美国BD公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司)。

1.1.3仪器 KHB(ST-360)酶标仪(中国上海)，CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter 公司)。

1.2方法

Tab 1 Correlation between CARMA3 expression and clinical characteristics of HCC patients

1.2.1组织微阵列免疫组化 手术切除的肿瘤标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。组织微阵列(TMA)由Ai-We-Er公司(中国武汉)制造。每个TMA 排列25对组织，切片4 μm厚，2 mm大小。使用超敏二步法进行免疫组化染色。将切片在二甲苯中脱石蜡，用梯度无水乙醇脱水，然后在0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中，在压力锅中煮沸3 min。用0.3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物活性，并将切片与正常山羊血清溶液在室温下孵育1 h以减少非特异性结合。将一抗(CARMA3 1 ∶50稀释，NF-κB 1 ∶200稀释)在4℃孵育过夜。次日二抗在室温下孵育1 h。

1.2.2细胞系和细胞培养 人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和正常肝细胞系HL-02均获自中国科学院细胞库(www.cellbank.org.cn)。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、5% CO2的培养箱中，每3 d更新培养基。

1.2.3MTT检测 取对数生长期的细胞，以3×103个/孔的密度接种到96孔培养板中，以10、20、30、40 μmol·L-1的七叶皂苷钠分别处理24、48、72 h。对照组与治疗组给予相同量的溶剂(DMSO)。然后，向每个孔中加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，将细胞在37℃下孵育4 h。加入150 μL DMSO，以溶解所得的晶体。使用酶标仪在570 nm处检测OD值。使用以下公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率/%=(1-OD实验组/ OD对照组)×100%。

1.2.4细胞凋亡检测 使用Annexin V/PI法检测细胞凋亡率。将细胞接种于6孔板，贴壁后用七叶皂苷钠处理48 h，胰蛋白酶消化，预冷PBS洗涤2次后，用100 μL缓冲液(1×108·L-1)重悬后，转移到5 mL培养管中，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，避光反应15 min，最后加入400 μL缓冲液至管中，通过流式细胞仪检测。

1.2.5Western blot 将细胞在RIPA裂解液中冰浴裂解30 min，4℃、15 000 r·min-1离心20 min。将上清液保存在-80℃。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加载到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到PVDF膜。5% BSA室温下封闭1 h，抗体CARMA3(1 ∶100)和NF-κB(1 ∶1 000)在4℃孵育过夜。与二抗(1 ∶10 000)在室温下孵育1 h。ECL试剂盒显色，Image J图像处理系统分析Western blot灰度值。

1.2.6统计学分析 采用SPSS 17.0版软件进行分析，临床基线资料和蛋白表达量相关数据采用χ2检验及Fisher确切概率法。Kaplan-Meier检验用于生存数据分析，log-rank cox用于差异性检验。

2 结果

2.1CARMA3在人肝癌组织中过表达且与临床病理、肿瘤直径、TNM分期及预后相关患者基本特征见Tab 1。TMA免疫组织化学染色结果显示(Fig 1)，CARMA3主要位于肿瘤细胞的细胞质中，与57例(57%)HCC患者相比，相同患者的相邻肝组织相对较高。 CARMA3在低分化和TNM恶性分期高的组织中的表达明显高于相应的正常组织(P=0.004，P=0.008)。在肿瘤直径大于5 cm的亚组中，肿瘤组织中CARMA3的表达差异有统计学意义(P=0.014)。然而，性别、年龄、HBV、AFP水平、Child-Pugh、肝硬化、肿瘤数目和微血管浸润亚组CARMA3表达差异无统计学意义(Tab 1)。在100例患者中，93例患者完全随访记录，分为高表达组和低表达组两组。Kaplan-Meier曲线表明，CARMA3或NF-κB过表达患者总体生存期、总体存活率低于CARMA3或NF-κB低表达者(Fig 1B)。结果表明，CARMA3和NF-κB的过表达与总生存期明显相关(P=0.027，P=0.005)，且CARMA3的表达程度明显与NF-κB表达程度相关(P<0.01)。

2.2七叶皂苷钠抑制HCC细胞增殖并诱导细胞凋亡七叶皂苷钠处理72 h后能明显抑制HepG2和Hep3B细胞株的增殖(IC50=46 μmol·L-1)。然而，七叶皂苷钠对HL-02细胞系的增殖几乎无影响。此外，七叶皂苷钠的抑制作用呈时间和剂量依 赖性(Fig 2)。Fig 3流式实验结果表明，七叶皂苷钠能够有效促进HepG2和Hep3B细胞系的凋亡。

Fig 1 Expression of CARMA3/NF-κB in hepatocellular carcinoma and adjacent paracancerous tissues and its correlation with prognosis

A:Expression of CARMA3 and NF-κB in HCC tissues was higher than that in paracancerous tissues; B:The patients with low CARMA3 and NF-κB expression had long overall survival time.

Fig 2 Effect of sodium aescinate on HCC cell lines and normal liver cell HL-02

A: Effect of sodium aescinate on three cell lines for 48 h; B: Effect on HepG2 of sodium aescinate was stronger with the concentration increase and time-dependent; C: Effect on Hep3B of sodium aescinate was stronger in a concentration- and time-dependent manner.**P<0.01vs24 h

Fig 3 Apoptosis of three cell lines at a concentration of 40μmol·L-1

A:The number of early apoptosis of SA-treated tumor cells was higher than that of the control group and not obvious in normal cells from the flow cytometry; B: The early apoptotic rate of SA-treated tumor cells was significantly higher than that of the control group, but no effect was detected on normal liver cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.3七叶皂苷钠下调肝癌细胞株CARMA3和NF-κB的表达40 μmol·L-1七叶皂苷钠处理肝癌细胞48 h后，Fig 4A免疫荧光实验发现，CARMA3的表达主要位于细胞质中，而NF-κB主要在细胞核中表达，和免疫组化结果一致，且七叶皂苷钠抑制HCC细胞中CARMA3和NF-κB的表达。Fig 4B Western blot结果进一步证实七叶皂苷钠可下调CARMA3和NF-κB表达(P<0.05)。

3 讨论

七叶皂苷钠是一种天然植物提取物，因其在抗炎、抗氧化方面取得良好疗效，被批准用于临床，但其抗肿瘤作用研究报道较少。齐世美等[10]报道，七叶皂苷钠能通过抑制Akt、ERK上游信号Src活性，诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，但其在抗肝癌中的作用尚未见相关报道。CARMA3蛋白与多种肿瘤的发生、发展相关，如肾癌、结肠癌、肺癌[11-14]，但在肝癌中的报道很少。在本研究中，我们使用TMA分析评估了HCC患者组织中CARMA3的表达及其临床相关性。体外研究结果表明，七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路，抑制肝癌细胞系的增殖并促进其凋亡，但对正常肝细胞无影响。

CARMA3在肝癌组织中的TMA染色结果显示，在低分化的HCC组织或肿瘤直径大于5 cm的肿瘤中CARMA3的表达较高，且表达程度与患者的总生存期呈正相关，CARMA3表达程度低的患者倾向更长的术后生存时间。本研究结果表明，CARMA3的表达程度与HCC组织中NF-κB的表达明显相关，更进一步证明CARMA3是NF-κB的上游调节因子，揭示CARMA3/NF-κB信号通路在肝癌患者中处于激活状态。体外研究发现，七叶皂苷钠抑制HCC细胞株的增殖并诱导其早期凋亡，细胞免疫荧光和Western blot实验证实，七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路发挥其抗肿瘤作用。更重要的是，我们发现，七叶皂苷钠在相同浓度下，对正常 肝细胞几乎没有细胞毒性作用。众所周知，HCC的化学疗法不尽人意，且对于治疗HCC的药物总是在Ⅲ期试验中失败；虽然索拉非尼被批准为HCC的一线分子靶向药物；然而索拉菲尼由于成本高，对患者有副作用，很难普及，且索拉非尼的耐药性也是一个挑战。因此，迫切需要找到一种有效和经济的药物。本研究结果显示，七叶皂苷钠满足这些条件，在治疗HCC中具有潜在的临床应用价值。总之，本研究发现CARMA3在肝癌组织中过表达，与HCC患者的预后相关，且七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路，能有效抑制人肝癌细胞的增殖。

A: Immunofluorescence was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB in cells; B: Western blot was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB; C: CARMA3 and NF-κB gray value ratio.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.