HPLC法同时测定桑菊感冒颗粒中5种有效成分的含量

2018-09-10崔佰吉张宏梅朱鹤云冯波

中国药房 2018年12期

崔佰吉张宏梅朱鹤云冯波

中图分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）12-1609-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.06

摘要目的：建立同时测定桑菊感冒颗粒中绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为WondasilTM-C18，流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm，进样量为5 μL。结果：绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸的检测进样量线性范围分别为0.014～0.560 μg（r=0.999 2）、0.022～0.880 μg（r=0.999 6）、0.010～0.400 μg（r=0.999 9）、0.016～0.640 μg（r=0.999 9）、0.011～0.440 μg（r=0.999 1）；定量限分别为0.752、0.647、0.483、0.372、0.242 mg/L，检测限分别为0.253、0.185、0.157、0.162、0.098 mg/L；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0%；加样回收率分别为 97.4%～100.9%（RSD=1.4%，n=6）、95.7%～99.0%（RSD=1.1%，n=6）、95.1%～98.1%（RSD=1.3%，n=6）、96.4%～99.8%（RSD=1.4%，n=6）、97.8%～100.4%（RSD=1.0%，n=6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于桑菊感冒颗粒中绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸含量的同时测定。

关键词桑菊感冒颗粒；高效液相色谱法；绿原酸；芦丁；连翘苷；槲皮素；甘草酸；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid in Sangju ganmao granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on WondasilTM-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was set at 254 nm. The sample size was 5 μL. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid were 0.014-0.560 μg（r=0.999 2），0.022-0.880 μg（r=0.999 6），0.010-0.400 μg（r=0.999 9），0.016-0.640 μg（r=0.999 9），0.011-0.440 μg（r=0.999 1）， respectively. The limits of quantitation were 0.752， 0.647， 0.483， 0.372， 0.242 mg/L； the limits of detection were 0.253， 0.185， 0.157， 0.162， 0.098 mg/L. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The average recoveries were 97.4%-100.9%（RSD=1.4%，n=6）， 95.7%-99.0%（RSD=1.1%，n=6）， 95.1%-98.1%（RSD=1.3%，n=6）， 96.4%-99.8%（RSD=1.4%，n=6）， 97.8%-100.4%（RSD=1.0%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid， rutin， phillyrin， quercetin and glycyrrhizic acid in Sangju ganmao granules.

KEYWORDS Sangju gamao granules； HPLC； Chlorogenic acid； Rutin； Phillyrin； Quercetin； Glycyrrhizic acid； Content determination

桑菊感冒顆粒收载于《中药成方制剂》（第二册），执行标准为WS3-B-0397-90[1]。该方由菊花、桑叶、连翘、芦根、甘草、苦杏仁、薄荷、桔梗等8味中药材组成。方中菊花平息肝火、疏散风热，可辅助治疗感冒、头痛等[2]，桑叶滋阴补血、清肺润燥、清热疏风、清肝明目[3]，二者合用具有清肺止咳、疏散上焦风热等功效[4]；连翘俗称“一串金”，有消肿散结、清热解毒、疏散风热的功效[5-6]；芦根可用于治疗热病烦渴、胃热呕吐、肺热咳嗽、肺痈吐脓、热淋涩痛等症[7]；甘草可用于治疗痈疽疮疡、咽喉肿痛、气喘咳嗽、脾胃气虚等症[8]；苦杏仁有润肠通便、平喘镇咳、镇痛抗炎等功效[9-10]；薄荷为辛凉性发汗解热药，内服可用于治疗流行性感冒、咽喉肿痛、头疼、目赤、身热、牙床肿痛等症，外用可用于治疗神经痛、皮肤瘙痒、皮疹和湿疹等症[11]；桔梗具有宣肺排脓、镇咳祛痰、消炎等功效[12]。

目前，该药的执行标准未对方中有效成分进行含量控制，同时2015年版《中国药典》（一部）[13]中收载的桑菊感冒片仅对方中的连翘苷进行含量测定。鉴于此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了桑菊感冒颗粒中绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素、甘草酸的含量，以期为该药的质量评价和相关标准完善提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型HPLC仪，包括LC20AT二元高压梯度泵、SPDM20A二极管阵列检测器、SIL20A自动进样器、LC-Solution色谱工作站（日本岛津公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 药品与试剂

绿原酸对照品（批号：071229，纯度：98.3%）、芦丁对照品（批号：080526，纯度：99.5%）、连翘苷对照品（批号：090106，纯度：99.0%）均由上海融禾医药科技发展有限公司提供；槲皮素对照品（批号：100081- 200907，纯度：98.9%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201317，纯度：99.4%）均由中国食品药品检定研究院提供；桑菊感冒颗粒（吉林医药学院药物制剂研究室按标准WS3-B-0397-90自制，批号：160401、160402、160403，规格：10 g/袋）；糊精（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20100712）；蔗糖（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20120510）；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WondasilTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，0→83% B；8～35 min，83%→30% B）；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液分别精密称取绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸铵对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加乙腈定容，摇匀，即得质量浓度分别为0.635、0.326、0.310、0.317、0.639 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密量取上述单一对照品贮备液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加乙腈稀释并定容，摇匀，即得混合对照品溶液（含绿原酸0.014 mg/mL、芦丁0.022 mg/mL、连翘苷0.010 mg/mL、槲皮素0.016 mg/mL、甘草酸0.011 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液取样品适量，研细，精密称取粉末2.0 g，置于50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）提取20 min，放冷至室温，加乙腈定容，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液按标准WS3-B-0397-90中桑菊感冒颗粒处方分别制备缺菊花、桑叶、连翘、芦根、甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备各阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、各阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，混合对照品各待测成分色谱峰分离良好，供试品各待测成分色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，且在相同位置上阴性对照无干扰峰出现。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”項下混合对照品溶液1、5、10、20、40 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下各单一对照品贮备液适量，分别按照一定的比例进行稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限。结果，绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸的定量限分别为0.752、0.647、0.483、0.372、0.242 mg/L；检测限分别为0.253、0.185、0.157、0.162、0.098 mg/L。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸峰面积的RSD分别为0.55%、0.09%、0.15%、0.19%、0.15%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：160401）适量，分别于室温避光环境下放置0、4、6、8、10 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸峰面积的RSD分别为0.38%、1.13%、0.53%、0.54%、0.70%（n=5），表明供试品溶液室温避光环境下放置10 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取样品（批号：160401）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量。结果，绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸的平均含量分别为0.318、0.516、0.237、0.392、0.254 mg/mL，RSD 分别为 0.86%、1.32%、0.94%、1.30%、1.07%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品细粉（批号：160401）6份，每份1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入一定量的单一对照品贮备液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.10 样品含量测定

取3批样品细粉各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各3份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

本试验中，通过结合二极管阵列检测器上得到的紫外吸收光谱图，确定了各待测成分的最佳检测波长分别为325 nm（绿原酸）、355 nm（芦丁）、276 nm（连翘苷）、375 nm（槲皮素）、250 nm（甘草酸），但考虑到便于试验操作，且各待测成分在254 nm波长处均有较好的吸收，故选择254 nm作为本研究的检测波长。

3.2 流动相的选择

本研究分别采用乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液以及甲醇-0.4%磷酸溶液5种流动相体系进行梯度洗脱。结果表明，采用乙腈-0.4%磷酸溶液作为流动相体系时的分离效果较好，且基線较稳定，故选择乙腈-0.4%磷酸溶液作为本研究的流动相体系。

3.3 有效成分的选择

桑菊感冒颗粒收载于《中药成方制剂》（第二册）[1]，原标准中没有对有关成分进行含量测定。桑菊感冒片收载于2015年版《中国药典》（一部），且规定连翘苷含量的最低限度为0.16 mg/g[13]。本试验中测得样品中连翘苷的平均含量为0.220 mg/g，符合2015年版《中国药典》（一部）规定的标准。为更好地控制本制剂的内在质量，本试验增加了绿原酸、芦丁、槲皮素和甘草酸的含量测定，且5种待测成分在同一色谱条件下可同时测定。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于桑菊感冒颗粒中绿原酸、芦丁、连翘苷、槲皮素和甘草酸含量的同时测定。

参考文献

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