健脾柔肝息风汤对抽动障碍模型大鼠脑组织中多巴胺和高香草酸的影响

刘微艳 朱沁泉 陈盼 陈创 张涤

〔摘要〕 目的 观察健脾柔肝息风汤对抽动障碍（tic disorder，TD）模型大鼠脑组织中多巴胺和高香草分组干预后酸（homovanillic acid， HVA）含量的影响，探讨其作用机制。方法 建立空白组，模型组，氟哌啶醇组，健脾柔肝息风汤高、中、低剂量组共6组，通过腹腔注射亚氨基二丙腈，建立抽动障碍模型大鼠，分组干预后再采用酶联免疫法（ELISA）测定脑组织中多巴胺（dopamine， DA）和高香草酸（homovanillic acid， HVA）的含量。结果 与空白组比较，模型对照组DA及HVA含量均降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，健脾柔肝息风汤高、中、低剂量组及氟哌啶醇组DA与HVA含量均升高（P<0.05或P<0.01）。结论 DA能系统及代谢产物HVA平衡失调与抽动障碍发病有关，而健脾柔肝息风汤具有调节DA能系统及代谢产物平衡的作用。

〔关键词〕 健脾柔肝息风汤，抽动障碍;多巴胺;高香草酸

〔中图分类号〕R285.5;R749.94       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.007

抽动障碍（tic disorder， TD）是一种具有遗传倾向的神经精神性疾病，主要表现在运动性抽动和发声性抽动，临床表现有：努嘴、眨眼、耸肩、鼓腹、踢腿等，严重影响了患儿的生活及发展，且此病的发病率呈上升趋势[1-2]。抽动障碍分为短暂性抽动障碍、慢性抽动障碍和多发性抽动症三种类型，目前治疗抽动障碍的药物以多巴胺受体拮抗剂为主，其中氟哌啶醇为首选药物，但其锥体外系等副作用明显[3]。中医认为此病与肝脾密切相关，肝常有余，肝旺生风，脾常不足，脾虚生风，风胜则动。张涤教授在临床中应用“抑木扶土”法，研发了治疗此病的经验用方——健脾柔肝息风汤（茯苓10 g，白芍10 g，钩藤10 g，僵蚕10 g，全蝎6 g，甘草2 g），此方具有疗效显著、副作用小的优势，为进一步明确其作用，本实验通建立TD大鼠模型，研究健脾柔肝息风汤对TD大鼠脑组织中多巴胺（dopamine， DA）、高香草酸（homovanillic acid， HVA）含量影响，探讨健脾柔肝息风汤的作用靶点。

1 材料和方法

1.1  实验动物

健康雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180～200 g[4-5]，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。许可证号：SYXK（湘2013-0004）。

1.2  药品与试剂

健脾柔肝息风汤方由茯苓、白芍、钩藤、僵蚕、全蝎、甘草组成，含生药量48 g，购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，按照临床等效剂量的4倍、2倍、1倍高剂量组12 g/（kg·d）、中剂量组6 g/（kg·d）、低剂量组3 g/（kg·d），然后分别按含生药0.48、0.24、0.12 g/mL配制成健脾柔肝息风汤药液。氟哌啶醇（湖南洞庭药业股份有限公司，规格1 mL∶5 mg）。生理盐水（湖南科伦制药有限公司，规格：100 mL∶0.9 g）等。

DA ELISA试剂盒（武汉华美，批号：CSB-E08660r），HVA ELISA试剂盒（武汉华美，批号：CSB-EQ07785RA），考马斯亮蓝快速染色液（前尘生物，20309ES03），甘氨酸（Biosharp，批号：BS003A），亚氨基二丙腈（湖南康合益生物科技有限公司）。

1.3  主要仪器

H1650R台式高速冷冻离心机，湘仪;PW-812全自动酶标洗板机，汇松;MB-530多功能酶标分析仪，汇松;DHP-500恒温培养箱，光明;L530自动平衡离心机，湘仪;MCT-150-C1.5 mL离心管，Axygen。

1.4  分组与造模[6]

60只SD大鼠随机分为6组，空白组、模型组、氟哌啶醇组、健脾柔肝息风汤高剂量组、健脾柔肝息风汤中剂量组、健脾柔肝息风汤低剂量组，每组10只。除空白组腹腔注射生理盐水3 mL/（kg·d）外，余5组腹腔注射亚氨基二丙腈150 mg/（kg·d），连续注射1周，则出现鼻嗅、仰头、摆头、躯体旋转等兴奋性增高、活动增多的表现，按Diammond[6]评分方法评分≥1分可判定造模成功。

1.5  干预措施

造模7 d后，空白组、模型组：灌胃给予等容量蒸馏水;氟哌啶醇组灌胃氟哌啶醇：0.5 mg/（kg·d）（氟哌啶醇配成混悬液，質量浓度为1 mL含0.025 mg药物）;健脾柔肝息风汤高、中、低剂量组灌胃健脾柔肝息风汤，按12、6、3 g/（kg·d）给药，每日1次，连续灌胃6周。

1.6  标本采集与检测

在末次给药72 h后，断头取脑，冰上迅速剥离纹状体，称重后液氮速冻放入-80 ℃冰箱保存待测。使用酶联免疫法（ELISA）检测脑组织DA、HVA含量，严格参照试剂盒说明操作。将各种试剂移至室温（18～25 ℃）平衡至少30min，按前述方法配制试剂，备用。加样：分别设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37 ℃温育2 h。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，置37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，置37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15～30 min。依序每孔加终止液50 μL，终止反应。在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的OD值，以OD值除以蛋白浓度所得的值表示DA、HVA的含量。

1.7  统计学方法

应用SPSS 17.0软件包，计量资料以“x±s”表示，多组间比较，方差齐性，则采用单因素方差分析，方差不齐，则采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计意义。

2 结果

健脾柔肝息风汤对TD模型大鼠脑组织中多巴胺及高香草酸的含量影响：与模型组比较，健脾柔肝息风汤各组DA及HVA含量均有升高（P<0.01）;氟哌啶醇组与健脾柔肝息风汤中、低剂量组比较DA及HVA含量均升高（P<0.05）;氟哌啶醇组与健脾柔肝息风汤高剂量组比较DA及HVA含量相当（P>0.05）。结果见表1。

3 讨论

DA是脑内重要神经递质，在控制行为和认知功能中具有重要作用[7]，异常的DA信号具有干扰前额叶皮质和纹状体环路的作用，长期的DA异常调节，可以导致两者功能紊乱[8-9]。此外黑质纹状体通路，它的纤维投射起自中脑黑质致密部的多巴胺能神经元，支配背侧纹状体（尾壳核），此通路为椎体外系的一个重要部分，它涉及运动的控制，是调节行为活动反应的基本结构，长期的DA异常调节，可以導致精神活动和运动功能紊乱。而HVA是DA在降解酶的作用下产生的主要代谢产物，通常被视为DA活性的主要指标[10]。有研究表明TD患儿血清及脑脊液中HVA较正常对照组有明显变化，佐证DA系统活性与TD发病具有关联性[11-12]，因此HVA可作为直接反应脑内DA代谢的标志。故DA及代谢产物HVA平衡失调均可能导致抽动障碍的发生。

本文建立抽动障碍大鼠模型（有相关文章及实验表明，抽动障碍老鼠选择大鼠及小鼠均可[4-5]），研究发现，与空白组比较，模型组DA及HVA含量均降低;与模型组比较，氟哌啶醇组DA及HVA含量升高;与模型组比较，健脾柔肝息风汤高、中、低剂量组DA及HVA含量均升高;氟哌啶醇是多巴胺受体拮抗剂，是治疗抽动障碍的主要药物，通过此实验说明健脾柔肝息风汤在治疗抽动障碍时，通过调节DA能系统及代谢产物平衡而起到相关作用。

传统中医学理论认为，TD多与肝脾功能失调有关，常表现为肝亢脾虚的特点。导师张涤教授从五行生克制化理论入手，根据肝风亢盛、脾虚夹痰的病理演变规律，提出本病病机为木亢土虚，肝风内动，治疗以“抑木扶土”法为纲，总结出“健脾柔肝息风汤”以平肝息风、健脾化痰。方中白芍柔肝、钩藤平肝为君药。白芍味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有柔肝敛阴、平抑肝阳的功效，其主要有效成分白芍总苷具有镇痛、镇静、抗炎、解痉作用[13-14]。钩藤味甘、苦，性凉，具有平肝息风的功效，现代临床中用于高热惊厥，惊痫抽搐等疾病中[15]，中药药理研究表明，钩藤及钩藤碱能明显降低大脑皮层的兴奋性，具有显著的抗惊厥、抗癫痫、保护神经元等作用[16-17]。茯苓健脾益气，僵蚕、全蝎善于驱风，三者共为臣药。茯苓味甘、淡，性平，入脾、心、肾经，具有健脾化痰，益气宁心的功效，临床中有改善学习记忆、镇静的作用[18]。僵蚕味辛、咸，性平，入肝、心、脾、肺经，具有息风止痉、活络通经等功能。现代研究表明僵蚕表面含有的草酸铵是其主要药理成分，具有镇静、抗惊厥作用[19]。全蝎具有息风、镇痉、通络止痛等作用，全蝎蝎毒的主要成分是抗癫痫肽，其作用依赖于单胺类神经递质的存在，药理实验证实全蝎醇提物有镇静作用[20]。甘草为使药，具有补益脾气，调和诸药的功效，具有提高免疫力的作用[21]。通过本次研究，发现健脾柔肝息风汤对TD大鼠模型脑组织中DA和HVA有调节平衡的作用，从而抑制抽动的发生，但其具体作用机制有待进一步深入研究。

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