油棕种壳厚度控制基因SHELL的SNP分子标记开发

石鹏 夏薇 肖勇 王永 曹红星 李东霞 雷新涛

摘 要： 油棕屬棕榈科多年生木本油料作物，果实含油量高达50%，且单位面积产油量高，享有“世界油王”美誉。油棕果实由外果皮、中果皮、内果皮（种壳）、种子四个部分组成，产油部分主要是中果皮和种子，其中种壳厚度是影响果实含油量的重要因素。SHELL基因控制种壳厚度，是一类MADS-box同源基因，SHELL基因在厚壳种和无壳种中的变异主要是第一个外显子上的两个SNP位点。该研究根据两个SNP位点进行特异标记开发，根据已知的油棕SHELL基因的序列，设计了4对SNP引物。4对SNP引物以2个SNP位点设计，每个SNP位点设计2对SNP标记，并均在引物3′端第二位引入强错配碱基。以2份薄壳种油棕材料和2份厚壳种油棕材料DNA为模板，扩增筛选油棕SHELL基因SNP引物。通过PCR扩增发现，设计的SHELL基因特异SNP标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r能够鉴别油棕厚壳种和薄壳种。再用24株油棕树进行特异性验证，发现该标记能较准确地判断油棕的厚薄壳。该研究结果表明SNP标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可用来进行油棕种质资源早期分子鉴定，为高产油棕品种选育提供了技术支撑。

关键词： 油棕， 种壳厚度， SHELL基因， 错配碱基， SNP标记

中图分类号： Q949.9， S59

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2018）02-0195-07

SNP markers development of SHELL controlling shell thickness in oil palm （Elaesis guineensis）

SHI Peng1， 2， XIA Wei3， XIAO Yong1， 2， WANG Yong1， 2， CAO Hongxing1， 2， LI Dongxia1， 2， LEI Xintao1， 2*

（ 1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang 571339， Hainan， China； 2. Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang 571339， Hainan， China； 3. Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract： Oil palm （Elaeis guineensis ） belongs to palmae perennial woody oil crop， known as “oil king of the world”， and its fruit oil content is up to 50%. Fruit of oil palm consists of exocarp， mesocarp， endocarp （shell） and seed， mesocap and seed is the resource of oil， and shell thicknees play an important role in fruit oil content. SHELL gene controls the shell thickness， which is a kind of MADS-box homologous gene. Moreover， variation of SHELL between dura and pisifera is mainly two SNP loci in the first exon. Specific markers were developed according to two SNP loci， in order to evaluate germplasm resources of oil palm early. Four SNP markers were designed according to SHELL gene sequence. Four pairs of SNP primers were designed with two SNP loci， which existed strong mismatch base in the second position from 3′-end respectively. Four pairs of SNP primers were amplified in two tenera palms and two dura palms to screen effective primers. PCR result showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r was able to identify dura and tenera palms effectively. Verification experiment using 24 plants revealed that this marker could accurately determine the shell thickness of oil palm. In this study， results showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r might be used for early molecular identification， which would provide technical support for high yield breeding of oil palm.

Key words： oil palm， shell thickness， SHELL gene， mismatch bases， SNP markers

油棕（Elaeis guineensis）是棕榈科油料作物，其生产的棕榈油和棕榈仁油应用广泛（Cornelius，1977；李瑞等，2009）。近年来，受益于全球食用油需求的迅猛增长和油棕种植面积的快速扩张，棕榈油和棕榈仁油产量达到4 500万t，占世界食用植物油产量的32%（Murphy，2009）。在2006年，就超越大豆，成为全球最重要的油料作物。然而，随着油棕种植面积的快速扩大，造成热带雨林生物多样性降低等生态危机也越来越严重（Wilcove & Koh，2010；Foster et al，2011；Koh & Wilcove，2008；Koh et al，2011）。在全球食用植物油需求继续增加，油棕种植面积不能继续扩大的前提下，提高油棕单位面积产油量是实现这些目标的唯一途径。油棕产油部分主要是果实，所以果实的含油量是影响单位面积含油量的重要因素。

在非洲油棕进化和育种过程中一个关键的事件就是包裹种仁的厚种壳消失。现在的非洲油棕有三种果实类型，厚壳型（dura），无壳型（pisifera）和薄壳型（tenera），其中薄壳种是厚壳种和无壳种的杂交种（Corley & Tinker，2007）。薄壳种油棕产油量高于厚壳种，是东南亚地区商业棕榈油生产的主要来源。Singh et al（2013a）通过测序进行同源定位，确定了控制油棕种壳厚度的基因是拟南芥中控制子房形成和种子发育的MADS-box基因STK的同源基因SHELL。这个基因控制着油棕最重要的经济性状，用其选育的薄壳种油棕也對全球食用油生产，生物能源和热带雨林保护产生有利影响。

油棕果实由四部分组成：外果皮、中果皮、内果皮（种壳）和种仁。内果皮发育成熟后形成类似椰子壳的纤维环，薄壳种油棕正是因为其种壳薄而获得更高的产油量。控制这种性状的SHELL基因是共显性单基因遗传。利用厚壳种与无壳种培育优良的薄壳杂交种显然是进行油棕常规育种的重要途径，然而仅仅依靠人工去鉴别育种亲本的类型显得费时费力，延长了育种周期，而且还不准确（Mathews et al，2008）。因此利用分子标记辅助育种成为了培育高产薄壳油棕的新途径。

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms， SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP大多是双等位基因，共显性遗传（Krawczak， 1999；Xing et al， 2005）。目前它已经作为新一代分子标记，在分子遗传学研究中发挥着重要作用（Liu et al，2012）。在植物分子生物学研究中，SNP标记已经受到各国学者的高度重视，目前在水稻、番茄、土豆、玉米、油菜和棉花等粮食和经济作物中开展了SNP研究（杨广阔等，2014；Hayashi et al，2004；姚祝平等，2015；Sattarzadeh et al，2006；乐素菊等，2012；孙妍妍等，2015；匡猛等，2016）。基于普通PCR技术的SNP标记开发具有低成本和便捷的优势，利用SNP标记对油棕进行辅助育种培育薄壳杂交种油棕开辟了一条新途径。本研究以2份薄壳种油棕和2份厚壳种油棕为实验材料，以SHELL基因为模板开发了4对SNP标记，为油棕种壳厚度基因SHELL的分子标记辅助育种奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料取自中国热带农业科学院椰子研究所椰子大观园，薄壳种油棕材料编号：B1、B2；厚壳种油棕材料编号：H4、H5。来自海口三江油棕基地的24株油棕单株为随机选取，编号为1-24。

1.2 方法

1.2.1 油棕种壳类型鉴定 取油棕单株上所结成熟油棕果实，用园艺专用剪刀剪开果实，用游标卡尺测量种壳厚薄，小于1 mm并且大于0 mm的认定为薄壳种，大于3 mm认定为厚壳种。

1.2.2 DNA的提取 取实验材料各单株油棕叶片1～2片，将其装入取样袋中，写明编号，用液氮速冻后备用。采用CTAB小样提取法（周丽霞等，2013）对油棕材料进行DNA提取。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解，用Nano Drop 2000测定DNA的浓度，其后将所有材料的DNA用灭菌ddH2O稀释到50 ng·μL-1备用。

1.2.3 引物设计 利用Primer primer 5和在线引物设计软件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/），以SHELL基因序列设计了4对SNP引物，本实验针对86 bp处的T-C转换和93 bp处的A-T颠换设计引物（表1）。其中，EgSh（L）-f和EgSh（P）-f为T-C转换处的正向引物；EgSh（K）-f和EgSh（N）-f为A-T颠换处的正向引物，EgSh（SNP）-2r为这4个引物的通用反向引物。

1.2.4 PCR扩增和电泳检测 PCR反应体系（20 μL）：5 μL模板DNA，2 μL 10×Taq Buffer，1.6 μL Mg2+，0.4 μL dNTP，0.3 μL Taq DNA聚合酶，8.7 μL ddH2O，1 μL正向引物，1 μL反向引物。PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统下检测拍照。

2 结果与分析

2.1 油棕种壳类型及SHELL基因变异

油棕种壳共有3种类型，厚壳、薄壳和无壳，本研究中利用收集到的厚壳种与薄壳种油棕种质资源来设计和鉴定引物。SHELL基因已经测序（Singh et al， 2013a），分析表明在SHELL基因第一个外显子86 bp和93 bp处各有一个SNP位点。其中86 bp处为C/T碱基转换，93 bp处为A/T碱基颠换（图1）。

2.2 等位基因PCR引物设计与筛选

为了提高引物特异性，该实验中分别在4条正向引物3′端的第二个碱基位置引入强错配碱基，并检测它们的扩增情况。实验中以B1、B2、H4和H5为材料进行引物筛选，通过筛选来确定这4对引物是否为等位基因的特异引物。引物EgSh（L）-f和EgSh（P）-f为针对86 bp处SNP位点设计的正向引物，EgSh（L）-f为与厚壳基因型相匹配的正向引物，EgSh（P）-f为与薄壳基因型相匹配的正向引物，同时在EgSh（L）-f和EgSh（P）-f的3′端第二位均引入C/T碱基错配；引物EgSh（K）-f和EgSh（N）-f为针对93 bp处SNP位点设计的正向引物， EgSh （K）-f为与厚壳基因型相匹配的正向引物，

EgSh（N）-f为与薄壳基因型相匹配的正向引物，同时在EgSh（K）-f和EgSh（N）-f的3′端第二位也均引入A/G强错配碱基。

四对引物分别在两个薄壳种油棕B1和B2，两个厚壳种油棕H4和H5中进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果显示，标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r在薄壳种中条带亮，而在厚壳种中没有检测到PCR产物，说明该标记能够区分开厚壳种和薄壳种（图2）。而其它三对标记均不能区分薄壳种和厚壳种，所以只有标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于进一步验证。

2.3 SNP标记验证

取海口三江油棕基地24株油棕单株的叶片，同时对这些单株上的成熟果实进行种壳厚度测量并记录。之后提取叶片DNA，用特异引物EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r做PCR扩增。在琼脂糖凝胶上电泳，結果显示所有已知为薄壳种油棕的单株，能够扩增出亮或较亮的目标条带，而已知为厚壳种油棕的单株则无亮条带或较弱（图3）。结果表明，EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r标记基本可以用于油棕种壳类型前期分子鉴定。

3 讨论与结论

根据公布的SHELL基因序列和SNP变异位点，增加引物3′端第二位错配碱基，设计了4对SNP标记。在已知种壳厚薄的4份油棕叶片DNA中进行筛选，初步发现标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以区分厚壳种和薄壳种。随后用该标记在24份油棕种质资源中扩增，发现该标记鉴定结果与实际种壳厚薄情况基本一致，标记EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于油棕种壳厚薄早期分子鉴定。

油棕种壳厚度与果实含油量关系密切，受母本基因型控制。在油棕杂交育种过程中，如果能对杂交后代进行早期鉴定，将会极大减少优良子代筛选的工作量和时间。早期有人寻找与油棕种壳厚度连锁的SSR等分子标记，但是准确度有限。随着油棕基因组测序完成，控制种壳厚度的SHELL基因序列被公布，使得开发更精确的SNP标记成为可能。本研究结合前人研究成果，在引物3′端引入强错配碱基的方法，获得较好的特异性扩增结果。理论上，引物3′末端碱基与模板互补才会在适合的条件下发生延伸，但是在实际PCR扩增过程中，3′末端单个碱基的错配不能阻止扩增延伸，因此在特异引物3′端第二位引入错配碱基就可以提高引物的特异性（Ye et al，2001；张育垚等，2012；黄代新等，2005）。强碱基错配类型为C/T和G/A；中等碱基错配类型为A/A、C/C、G/G、T/T；弱碱基错配类型为C/A和G/T。因此，该实验中为了获得较好的特异扩增效果，在引物3′端第二位上引入了C/T和A/G强错配碱基。

验证实验结果也显示，该标记能够初步用于油棕厚壳种和薄壳种的分子鉴定。目前，分子标记辅助选择已经在包括橡胶和木薯等热带作物得到应用，相比之下，油棕分子标记辅助选择技术的应用还比较滞后（郑燕梅等，2013；周龙华和蒋立希，2016）。多态性丰富，遗传稳定性高的SNP标记作为第三代分子标记，便于应用普通PCR技术进行检测，在油棕等木本作物中应用前景广阔。国外很早就有油棕种壳厚度控制基因SHELL的相关研究报道，但直到2013年，随着油棕全基因组序列测序完成，SHELL基因的全部序列才得以公布，为本研究中SNP标记开发奠定了基础（Singh et al，2013b）。本研究利用最新公布的SHELL基因序列设计分子标记，所开发的SNP标记具有一定的稳定性和可靠性，这将为油棕种壳厚度控制基因SHELL的分子标记辅助育种提供有效的工具。下一步将收集无壳种油棕资源，设计能同时鉴定无壳种、厚壳种和薄壳种油棕的SNP分子标记。

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