杨树腐烂病菌与不同寄主互作后致病力分化研究

严海璘 张王斌 朱宗财 仪子博 王飞亚 岳娟

摘要： 将DSYS菌株接种到新疆杨、银白杨、胡杨和灰杨枝条及叶片上进行发病率、显症时间、产孢体出现时间、病斑扩展速度的研究结果表明，DSYS菌株均能使4种不同寄主健康的枝条发病，在胡杨和灰杨枝条上第3 d开始显症，显症时间最早；在新疆杨枝条上第10 d开始显症，显症时间最晚，且产孢体形成需要时间最长达到14 d；在银白杨枝条上病斑扩展速度最快，为1.46 cm/d。DSYS菌株经历不同寄主培养后，继代菌株在病斑扩展速度和发病特征上发生明显分化现象，在新疆杨和灰杨连续培养3代后病斑扩展速度呈增加趋势且达到显著性差异，在胡杨连续培养3代后病斑扩展速度没有达到显著性差异，在银白杨上连续培养后病斑扩展速度在继2代与继1代和继3代表现上有显著性差异。

关键词： 杨树腐烂病菌； 致病性； 抗病性； 扩展速度； 产孢体

中图分类号： S 718. 8， S 792. 11 文献标识码： A

文章编号： 1001 - 9499 （2018） 02 - 0020 - 05

杨树是新疆主要防护林树种之一，在绿洲农业生产中起着极其重要的作用。近年来，杨树腐烂病（Cytospora chrysosperma）发生蔓延迅速，造成大面积防护林带死亡，给脆弱的的绿洲生态农业带来极大的威胁。新疆是林木腐烂病发生最严重的地区之一， 其中杨树腐烂病的发生程度最为严重[ 1 - 4 ]。通过测定4种不同寄主对杨树腐烂病菌的抗病性和不同寄主继代菌株的致病性，为进一步探索杨树与腐烂病间的互作及进行抗病育种提供数据基础。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌种

供试菌种为南疆农业有害生物综合治理重点实验室保存的杨树腐烂病菌菌株DSYS，分离于阿拉尔11团的杨树发病枝条上，按常规的组织分离法[ 5 ]分离，经单孢分离后获得纯菌株，用甘油管藏法在-80 ℃冰箱中保存，试验前在PDA平板上25 ℃全光照培养3天活化以备用。

1. 1. 2 供试培养基

PDA培养基：土豆200 g，加蒸馏水1 000 ml，沸水煮30 min后过滤上清液，加入蒸馏水补至总体积1 000 ml，加琼脂20 g，葡萄糖20 g，煮至琼脂融化，121 ℃，30 min高温灭菌备用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 枝条组织烫伤法

在阿拉尔市塔里木大学校园内于下午15时至16时采集1～2年生健康且生长一致的新疆杨（Populus bolleana）、银白杨（Populus alba）下部枝条；在阿拉尔市塔里木大学东门外于下午15时至16时采集1～2年生健康且生长一致的胡杨（Populus euphratica）、灰杨（Populus pruinosa）下部枝条。将采集的枝条截成15cm长小段，先用蒸馏水冲洗枝条3遍，之后用75%酒精擦拭，再用无菌水冲洗3遍。将无菌打孔器在酒精灯上烧热后在枝条上打出直径5 mm的圆形伤口，再将DSYS菌株用打孔器打成直径5 mm菌饼接种在伤口处。然后将接种好的同一树种的枝条每10支放在一个消毒盘中，消毒盘底部用一层纱布铺垫，并倒入适量无菌水保湿，最后用保鲜膜将消毒盘口封住，在25 ℃全光照培养箱中培养观察。

1. 2. 2 叶片组织针刺法

叶片组织针刺法采[ 6 ]用10针针刺法接种腐烂病菌。在南疆农业有害生物综合治理重点实验室周围，于下午15时至16时采集健康且生长大致相同的新疆杨叶片若干，将叶片用蒸馏水冲洗3遍后，用75%酒精表面消毒，再用无菌水冲洗3遍后备用。将消毒针烧红灭菌，在叶片正面刺10针，刺伤部位应均匀分布在直径5 mm的圆形区域内，并避开叶片主脉。将直径5 mm菌饼接种在针刺处，接种好的叶片放于大塑料皿中，皿内用纱布铺垫，倒入适量无菌水保湿，每个皿内放一片叶片，在25 ℃全光照培养箱中培养观察。

1. 2. 3 继代菌株的获取

采用组织烫伤法将DSYS菌株分别接种到新疆杨、银白杨、胡杨和灰杨枝条上，待显症并出现白色产孢体后，进行分离和纯化，获得不同寄主的继1代菌株，即新疆杨继1代菌株、银白杨继1代菌株、胡杨继1代菌株和灰杨继1代菌株，采用上述方法，将不同寄主继1代菌株接种到新的枝条上进行培养、分离和纯化，继而获得不同寄主继2代菌株和继3代菌株。

1. 3 研究内容

1. 3. 1 DSYS菌株对4种寄主的致病性

采用枝条组织烫伤法将DSYS菌株分别接种到新疆杨、银白杨、胡杨和灰杨枝条上进行培养，观察、记录其在各寄主上的发病率、开始显症时间、产孢体形成时间和病斑扩展速度（采用十字交叉法）。

1. 3. 2 不同寄主继1代菌株对新疆杨的致病性

将新疆杨继1代菌株、銀白杨继1代菌株、胡杨继1代菌株和灰杨继1代菌株采用枝条组织烫伤法及叶片组织针刺法接种在新疆杨枝条及叶片上，观察、记录不同寄主继1代菌株在新疆杨枝条及叶片上的发病率、开始显症时间、产孢体形成时间和病斑扩展速度。

1. 3. 3 不同寄主继2代和继3代菌株对新疆杨的致病性

将不同寄主继2代菌株和继3代菌株采用叶片组织针刺法接种在新疆杨叶片上，观察、记录不同寄主继2代和继3代菌株在新疆杨叶片上的发病率、开始显症时间、病斑扩展速度和发病特征。

2 结果与分析

2.1 DSYS菌株对4种寄主的致病性

试验结果（表1）表明，DSYS菌株均能使健康的杨树枝条发病。胡杨、灰杨与新疆杨枝条开始显症时间明显不同，胡杨和灰杨的枝条最早发病，新疆杨的枝条最晚发病。灰杨枝条在第8天形成产孢体，而新疆杨枝条在第14天出现产孢体。病斑扩展速度在不同寄主上存在明显差异，其中银白杨和胡杨间达到了显著性差异。新疆杨枝条的产孢体较少且稀疏，银白杨和胡杨产孢体特征相同；灰杨枝条形成的产孢体较多且主要集中在病斑周围，与其它3种不同寄主枝条产孢体特征有较大差异。

2. 2 不同寄主继1代菌株对新疆杨的致病性

将4种不同寄主继1代菌株接种到新疆杨枝条和叶片上的观测结果（表2）表明，4种不同寄主继1代菌株均能使新疆杨枝条和叶片发病，发病率一致。4种不同寄主继1代菌株接种新疆杨枝条后第3天开始显症；接种新疆杨叶片后，银白杨继1代菌株较其它3种寄主继1代菌株开始显症时间晚1天。灰杨继1代菌株接种新疆杨枝条后形成产孢体时间最早，新疆杨继1代菌株接种新疆杨枝条后形成产孢体时间最晚，银白杨继1代菌株和胡杨继1代菌株接种新疆杨枝条后形成产孢体的时间相同。银白杨继1代菌株接种新疆杨枝条后病斑扩展速度最快，胡杨继1代菌株接种新疆杨枝条后病斑扩展速度最慢，且4种杨树继1代菌株接种新疆杨枝条后的病斑扩展速度存在显著性差异。胡杨继1代菌株接种新疆杨叶片后产生的病斑扩展速度最快，银白杨继1代菌株接种新疆杨叶片后产生的病斑扩展速度最慢，且银白杨继1代菌株、胡杨继1代菌株和灰杨继1代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度存在显著性差异，银白杨继1代菌株和新疆杨继1代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度无显著性差异。

2. 3 不同寄主继2代菌株对新疆杨的致病性

观测结果（表3）表明，4种不同寄主继2代菌株均能使新疆杨叶片发病，且发病率均为100%。胡杨继2代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度最快，银白杨继2代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度最慢。新疆杨继2代菌株、银白杨继2代菌株和胡杨继2代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度有显著性差异，胡杨继2代菌株和灰杨继2代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度无显著性差异。4种不同寄主继2代菌株接种新疆杨叶片后病斑均呈黑褐色，且侵染完全后叶片均呈褐色，散发茶叶味。新疆杨继2代菌株和银白杨继2代菌株接种新疆杨叶片后都是从叶片边缘开始发病，而胡杨继2代菌株和灰杨继2代菌株接种新疆杨叶片后都是从针刺部位开始发病。

2. 4 不同寄主继3代菌株对新疆杨的致病性

观测结果（表4）表明，4种不同寄主继3代菌株均能使新疆杨叶片发病，且发病率均为100%。银白杨继3代菌株接种新疆杨叶片后第2天才开始发病。灰杨继3代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度最快，银白杨继3代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度最慢。4种杨树继3代菌株接种新疆杨叶片后病斑扩展速度有显著性差异。新疆杨继3代菌株、胡杨继3代菌株和灰杨继3代菌株接种新疆杨叶片后发病时均从针刺部位开始出现黑褐色病斑，且侵染完全后叶片呈褐色散发茶叶味，而银白杨继3代菌株接种新疆杨叶片后黑褐色病斑分散在叶片表面及周围，只有很淡的茶叶味。

2. 5 4种不同寄主不同继代菌株致病力的变化

新疆杨不同继代菌株接种到新疆杨叶片上，开始发病时间和发病率相同，病斑扩展速度随代数的增加而增加，且存在显著性差异。银白杨不同继代菌株接种到新疆杨叶片上，发病率相同，开始发病时间减少后又增加，病斑扩展速度增加后又减少，且银白杨继2代菌株接种新疆杨叶片后的病斑扩展速度与银白杨继1代和银白杨继3代菌株接种新疆杨叶片后的病斑扩展速度存在显著性差异，银白杨继1代与银白杨继3代菌株接种新疆杨叶片后在病斑扩展速度上无显著性差异。胡杨不同继代菌株接种到新疆杨叶片上，开始发病时间和发病率相同，病斑扩展速度增加后又减少，但是3代之间病斑扩展速度无显著性差异。灰杨不同继代菌株接种到新疆杨叶片上，开始发病时间和发病率相同，病斑扩展速度随代数增加而增加，且存在显著性差异（图1）。

3 结 语

3. 1 4种不同寄主对来源于腐烂病菌DSYS菌株的抗性在不同方面的表现存在明显差异，新疆杨接种后潜育期较长且产孢体形成需要时间较长，但在胡杨上潜育期较短，病斑扩展速度较慢。DSYS菌株经历不同寄主培养后，继代菌株致病力发生明显分化现象，在胡杨上连续培养3代后致病性变化没有达到显著性差异，在新疆杨和灰杨上连续培养后致病性呈现增强趋势且达到显著差异，在银白杨上连续培养后致病性表现出不稳定现象。

3. 2 将杨树腐烂病菌DSYS接种在新疆杨、银白杨、胡杨和灰杨离体枝条上的观测结果表明，DSYS菌株均能使4种不同寄主感病，但感病程度在显症时间、产孢体形成时间和发病特征上有所差异，这与杜琴等[ 2 ]研究结果：同一菌株对不同寄主的致病力有差异的结论基本一致，但造成致病力差异的原因和机理有待于深入的研究。

3. 3 继代培养一般会引起微生物退化，但也不排除使微生物增强适应性的可能。蔡国贵等对白僵菌进行继代培养，发现 11 次继代培养后不但没有引起退化，其毒力还有所增强[ 7 - 8 ]。将4种寄主继1代菌株接种到新疆杨枝条上发现，显症时间相同，但新疆杨继1代菌株在新疆杨枝条上的潜伏期较长，病斑扩展速度较慢，这与孔利等[ 9 ]：不同寄主来源的 C.sacculus菌株对原分离寄主枝条的致病力最强，对其他树种枝条的致病力较弱的结论有明显差异。将不同寄主继代菌株接种新疆杨上发现，新疆杨继代菌株接种新疆杨上的致病力并不强于其它3种不同寄主菌株接种新疆杨上的致病力，这与陈晓忍等[ 10 ]不同寄主来源的腐烂病菌在自身寄主上的致病力较在其它寄主上强的结论有明显差异。本研究表明，新疆杨继代菌株和灰杨继代菌株随继代次数增加致病力增强，银白杨继代菌株和胡杨继代菌株随继代次数增加致病力先增强后减弱，这与刘海英[ 11 ]等：随继代次数增加，菌丝生长速度变慢、产孢量下降、分生孢子变小、致病性显著降低、表现出明显退化现象有明显差异，其原因可能是由于在不同寄主上连续培养进行互作后引起的。摸清杨树腐烂病菌对4种杨树的致病性强弱和杨树被腐烂病侵染时的抗性还需做进一步的酶活性分子实验。

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第1作者简介： 严海璘（1996-）， 男， 本科生， 研究方向为植物病理学。

通讯作者： 张王斌（ 1974-）， 男， 副教授， 研究方向为林果树木腐烂病。

（责任编辑： 王 岳）