利莫那班对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的抑制作用及其机制研究

扈晓霞 韩世飞 李晶

摘 要 目的：研究利莫那班对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌细胞肥大的抑制作用及其机制。方法：取大鼠心肌细胞接种于6孔板中，密度调整为2×105 L-1，分为空白对照组、模型组、阳性对照组（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高浓度组（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5组加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大細胞模型，然后分别加入相应浓度的药物，培养24 h后，观察并测量每一个视野内球形细胞的直径和细胞数量，检测心肌细胞中Ca2+浓度、一氧化氮（NO）含量、一氧化氮合酶（NOS）活性和Ⅰ型大麻受体（CB1）蛋白表达情况。结果：各组心肌细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较，模型组心肌细胞直径明显增大，心肌细胞中Ca2+浓度和CB1蛋白表达水平均明显增加，NO含量和NOS活性明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，阳性对照组和利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞直径明显缩小，心肌细胞中Ca2+浓度和CB1蛋白表达水平均明显降低，NO含量和NOS活性明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05），且利莫那班组作用呈浓度依赖性。结论：利莫那班可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，其作用机制可能与降低Ca2+浓度、下调CB1蛋白表达有关。

关键词 利莫那班；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞肥大； Ca2+浓度；Ⅰ型大麻受体

中图分类号 R915；R966 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）21-2921-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.10

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of rimonabant on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ（Ang Ⅱ） and its mechanisms. METHODS： Rat cardiomyocytes were incubated in 6 well culture plates with density of 2×105 L-1. They were divided into blank control group， model group， positive control group （losartan10 μmol/L）， rimonabant low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups （0.1，1.0， 5.0 μmol/L）. The latter 5 groups were cultured with 0.1 μmol/L Ang Ⅱ to induce cardiomyocyte hypertrophy model， and then given relevant concentration of drugs. After cultured with 24 h， diameter and number of spherical cells in each field of vision were observed and measured. The Ca2+ concentration， NO content， NOS activity and protein expression of cannabinoid receptor 1（CB1） in cardiomyocyte were determined. RESULTS： There was no statistical significance in the number of cardiomyocyte （P>0.05）. Compared with blank control group， the diameter of cardiomyocytes in model group increased， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were increased significantly； NO content and NOS activity decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， the diameter of cardiomyocytes in positive control group， rimonabant low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups were decreased significantly， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were decreased significantly； NO content and NOS activity increased significantly， with statistical significance （P<0.05）， and the effects of the rimonabant groups were dose-dependent. CONCLUSIONS： Rimonabant can inhibite cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ， the mechanism of which may be associated with the decrease of Ca2+ concentration and protein expression of CB1.

KEYWORDS Rimonabant； AngiotensinⅡ； Cardiomyocyte hypertrophy； Ca2+ concentration； Cannabinoid receptor 1

利莫那班是人类发现的首个Ⅰ型大麻受体（CB1）抑制剂，利莫那班作为新型减肥药，2006年在欧盟批准上市，用于超质量或肥胖的成人患者[1]。此外，利莫那班对调节人体胰岛素增敏、辅助戒烟、改善患者脂代谢紊乱具有辅助作用[2]。但是由于利莫那班有可能会增加患者精神方面风险，赛诺菲-安万特（Sanofi-Aventis）公司于2007年6月29日宣布撤消其在美国的新药上市申请[3]。近年来，人们不断研究证实，生理浓度下内源大麻素在体内发挥着多种生物学效应，如心血管效应、抗炎及保护内皮细胞等作用[4]。有研究者报道，利莫那班可通过下调钙离子（Ca2+）-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、心肌营养素1（CT-1）的表达显著改善慢性间歇低氧诱发的心肌肥厚[5-6]。为进一步探讨CB拮抗对肥大的原代乳鼠心肌细胞的影响及可能机制，本实验室通过前期研究发现[7]，CB1广泛表达于人肾脏上皮细胞HEK293中，参与到HEK293细胞一系列的生理过程中。但拮抗CB1与心肌细胞肥大是否同样存在相关性，尚未见报道。本实验用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导原代乳鼠心肌细胞建立心肌肥大细胞模型，研究利莫那班对心肌细胞肥大的抑制作用及其机制，为CB1抑制剂利莫那班预防心血管系统疾病提供新的理论依据。

1 材料

1.1 仪器

qTOWER2.0型荧光定量多聚酶链式反应（PCR）仪 和Chemstudio SA2型多功能成像系统（德国耶拿公司）；Gene Pulser Xcell型电转仪（美国Bio-Rad公司）；D- 35578 Wetzlar型Leica荧光显微镜（德国Leica Microsystems公司）；紫外-可见分光光度计（美国Beckman公司）；SpectraMax M4型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 药品与试剂

利莫那班（批号：20170506，纯度：≥99.8%）和Ang Ⅱ（批号：HZB0537，纯度：>99%）均购自美国Sigma公司；氯沙坦钾胶囊（北京万生药业有限公司，批号：H20080015，规格：每粒50 mg）；小牛血清（批号：16010-159）和DMEM培养基（批號：11995-065）均购自美国Invitrogen Gibco公司；SYBR?GREEN PCR Master Mix（美国Applied Biosystem公司）；CB1基因引物与Ca2+荧光探针（上海吉凯基因化学技术有限公司）；生物素化抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批号：TA319567）、辣根过氧化物酶（HRP，批号：HZB0173）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号：A5441）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号：TA309157）均购自北京中杉金桥生物技术公司；兔抗鼠CB1一抗（批号：A-AP19620c）、反转录试剂盒（批号：AK5602）均购自重庆卓诺生物技术有限公司；一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的测定试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：ml059067）。

1.3 动物

清洁级，新生1～2 d SD大鼠，50只，♂，体质量5.5～6.5 g，来源于重庆医科大学动物实验中心，实验动物使用许可证号为SYXK（渝） 20022007，本实验通过重庆三峡中心医院伦理委员会同意开展相关动物实验研究。

2 方法

2.1 细胞培养与鉴别

无菌条件下，取新生1～2 d SD大鼠心室肌，切碎成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶和D-Hanks消化液混悬后，于37 ℃磁力搅拌消化10 min左右，反复数次，直至碎片完全消化，吸出上清液，加入含5%小牛血清的培养液终止消化。收集分离包含心肌细胞的小牛血清DMEM 培养液，梯度贴附法去除心肌周围细胞，以 5×105 L-1密度接种于6孔板中，置于CO2培养箱中培养48 h后，换DMEM 培养基适应性培养10 h。免疫组化细胞学鉴定心肌细胞：心肌细胞培养在6孔板中，检测时用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗去除血清和杂质，4%多聚甲醛固定15 min；1%牛血清白蛋白封闭30 min；加β-actin一抗（稀释比例1 ∶ 500），4 ℃过夜；次日加生物素化抗鼠IgG二抗（稀释比例1 ∶ 500），37 ℃孵育30 min；加HRP标记的链酶卵白素；3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染胞核，系列酒精脱水，中性树脂封片，显微镜观察。心肌细胞贴壁生长，单细胞有1～2个核，最终形成放射排列同心圆；培养24 h后心肌细胞开始出现自发性搏动；免疫组化细胞学鉴定显示，胞质棕黄色丝状物为免疫化学染色阳性心肌细胞，阳性率达98%以上，可满足进一步试验需求。

2.2 分组与给药

试验分为空白对照组、模型组、阳性对照组（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高浓度组（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5组加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大细胞模型，然后改为含相应浓度药物的DMEM 培养液（用二甲基亚砜溶解利莫那班后DMEM稀释，配制成浓度分别为0.1、1.0、5.0 μmol/L标准液），置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h后检测。

2.3 心肌细胞计数与大小的测定

心肌细胞以2×105 L-1密度接种于6孔板中，按“2.2”项下分组给药，加药培养24 h后，用D-Hanks液快速冲洗长满细胞的培养皿3次，加入0.25%胰蛋白酶，消化8 min后，加入10%小牛血清培养液终止消化。显微镜下观察细胞形状，在每一个视野内按白细胞计数法对心肌细胞进行计数，并用测微器测量心肌细胞的直径。

2.4 荧光探针测定心肌细胞中Ca2+浓度

心肌细胞以2×105 L-1密度接种于6孔板中，按“2.2”项下分组给药，每组3个复孔，加药培养24 h后用无菌PBS清洗5次，加入终浓度为3 ?mol/L的Ca2+荧光探针，在培养箱中继续培养1 h，PBS清洗5次，加入培养基，通过荧光显微镜4′ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）滤光片下观察，以340 nm为激发波长，510 nm为吸收波长，测定灰度值（F值）。根据预先建立的F值与Ca2+浓度之间的相互关系，计算Ca2+浓度。

2.5 测定心肌细胞中NO 含量和NOS 活性

心肌细胞以2×105 L-1密度接种于6孔板中，按“2.2”项下分组给药，每组3个复孔，加药培养24 h后，收集上清液，根据试剂盒说明书测定心肌细胞中NO含量和NOS活性。

2.6 Western blot法测定心肌细胞中CB1蛋白表达

取各组细胞加药培养24 h后，胰酶消化，用预冷的PBS清洗3次，加入裂解缓冲液100 μL裂解细胞，超声破碎细胞膜，15 000 r/min（离心半径9 cm）离心20 min，提取上清液蛋白质，用考马斯亮蓝法测定样品中蛋白浓度。取3～5 ?L蛋白样本上样，行10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离后转膜，在含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭2 h。加入一抗兔抗大鼠CB1抗体（稀释比例1 ∶ 300），4 ℃孵育过夜，加入HRP标记二抗（稀释比例1 ∶ 3 000），室温孵育2 h，化学发光法显色。以目标蛋白与内参GAPDH的吸光度值（OD值）比值为相对表达量，评价目的蛋白的表达水平。

2.7 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 心肌细胞计数与大小的变化

显微镜下，心肌细胞均呈球形。各组心肌细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较，模型组心肌细胞直径明显增大（P<0.05）。与模型组比较，阳性对照组和利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞直径明显缩小（P<0.05）。与阳性对照组比较，利莫那班低浓度组心肌细胞直径明显增大（P<0.05）。各组心肌细胞数量、直径的测定结果见表1。

3.2 心肌细胞中Ca2+浓度变化

与空白对照组比较，模型组心肌细胞中Ca2+濃度明显升高（P<0.05）。与模型组比较，阳性对照组和利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞中Ca2+浓度明显降低（P<0.05）。与阳性对照组比较，利莫那班低浓度组心肌细胞中Ca2+浓度明显升高（P<0.05）。各组细胞中Ca2+的荧光染色图见图1，Ca2+浓度测定结果见表1。

3.3 心肌细胞中NO含量和NOS活性的变化

与空白对照组比较，模型组心肌细胞中NO含量和NOS 活性明显降低（P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组和利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞中NO含量和NOS 活性明显增加（P<0.05）。与阳性对照组比较，利莫那班低、中浓度组心肌细胞中NO含量和NOS 活性明显降低（P<0.05），利莫那班低、高浓度组心肌细胞中NO含量和NOS 活性差异具有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中NO含量和NOS活性的测定结果见表2。

3.4 心肌细胞中CB1蛋白表达变化

与空白对照组比较，模型组心肌细胞中CB1蛋白相对表达量明显增加（P<0.05）。与模型组比较，阳性对照组和利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞中CB1蛋白相对表达量明显减少（P<0.05）。与阳性对照组比较，利莫那班低、中浓度组心肌细胞中CB1蛋白相对表达量差异具有统计学意义（P<0.05） 。各组细胞中CB1蛋白表达的电泳图见图2，CB1蛋白相对表达量的测定结果见表2。

4 讨论

我国心血管疾病患病人数处于持续上升阶段，心血管疾病病死率居死亡率首位[8]。心肌细胞肥大是导致心脏疾病和心脏猝死的危险因素，抑制心肌细胞肥大备受关注[9-10]。心肌接受刺激发生代偿，在最初代偿期心肌可提高心脏泵血功能，在病因持久作用下，肥大心肌功能失去代偿功能而转变为心衰，寻找针对心肌肥大的治疗策略一直是心血管疾病研究领域的热点之一。

Ang Ⅱ是公认的促心肌肥大因子，本研究采用Ang Ⅱ诱导建立体外心肌肥大细胞模型，倒置显微镜观察显示模型组心肌细胞直径显著增加（P<0.05），心肌细胞肿胀和分界不清的病理改变，提示心肌肥大细胞模型建立成功，Ang Ⅱ增加模型组心肌细胞胞膜CA1蛋白表达，而拮抗CB1可降低胞膜CB1的表达且随着利莫那班浓度增加呈浓度依赖性。有研究显示，CB1活性升高可增加食欲、促进摄食等[11-12]，同时周围组织能量代谢异常，可引起体质量增加，引发血脂异常，造成心肌细胞肥大。利莫那班可选择性抑制CB1，临床已有研究结果显示，拮抗CB1可减轻炎症、改善代谢、降低血压、抑制动脉粥样硬化发展[13]。心肌细胞Ca2+浓度升高是导致心肌肥大的基本信号，胞内Ca2+浓度升高可激活Ca2+敏感的钙调磷酸酶（CaN），活化T细胞核因子3和锌指转录因子，激活多个相关基因如心钠素（ANF）等表达，促进心肌肥大。国外有文献报道，CB1激动后也可促进胞内“钙池”释钙和Ca2+离子跨膜转运增加。本试验模型组心肌细胞中Ca2+浓度显著高于正常对照组，这一结果与前人研究[13-14]结果吻合。利莫那班低、中、高浓度组心肌细胞中Ca2+浓度显著低于模型组，笔者推测利莫那班拮抗CB1受体可能通过抑制Ca2+释放和抑制突触后电位，降低心肌细胞内Ca2+浓度。NO能抑制心肌细胞分裂和增殖，其激活鸟苷酸环化酶而抑制L型Ca2+内流，最终减弱核转录因子（NFAT）核移位和转录活性，发挥抗心肌肥大的作用。本研究结果显示，利莫那班能明显增强NOS的活性（P<0.05）、促进NO的释放（P<0.05），这一作用对心肌细胞肥大也具有保护作用。

近年研究人们发现花生四稀酸乙醇胺等内源性大麻素在糖代谢紊乱、氧化应激、炎症因子活化等生理病理过程发挥重要作用[15-16]，CB1表达一定程度上可评价体内大麻系统发生的变化[17]。本研究结果证实，利莫那班能明显降低Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞中CB1的表达、抑制心肌细胞中Ca2+浓度的升高和增强NOS活性并促进NO的释放，其作用效果与氯沙坦相当。有关CB1拮抗药对心肌肥大作用的影响及其细胞学机制目前并不完全清楚，其可能通过拮抗CB1，调节食欲、摄食、糖脂代谢、能量代谢、氧化应激、血脂异常等病理过程发挥改善心肌细胞肥大效应[12，18-19]。

综上所述，利莫那班对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大具有抑制作用，呈浓度依赖性，抑制机制可能与降低Ca2+浓度、下调CB1蛋白表达有关，这一研究结果提示CB1可作为防治心室肥厚的潜在靶点，具有潜在应用前景。

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（收稿日期：2018-03-19 修回日期：2018-09-18）

（编辑：邹丽娟）