镁基抗菌织物抗菌性能测试研究

沙林 王滢 李倩 朱益民 王宁会 赵娇

摘要：国内外对纺织品抗菌性能的评价各不相同，对不同类别的纺织品也没有公认和统一的测试标准，因此采用恰当的实验方法对镁基抗菌织物进行测试，能够保证测试结果的准确性。采用改良AATCC100法和改良振荡法对镁基抗菌织物的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌性能进行测试。结果表明：镁基抗菌织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，且两种方法所得结果接近、结论相同。镁基抗菌织物对大腸杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。

关键词：镁基抗菌织物；测试标准；改良AATCC100；改良振荡法；抑菌率

中图分类号：TS195.5文献标志码：A文章编号：1009-265X（2018）03-0066-05Study on the Antibacterial Property of MagnesiumBased Antibacterial Fabrics

SHA Lin1， WANG Ying1， LI Qian1， ZHU Yimin1， WANG Ninghui2， ZHAO Jiao1

（1.Institute of Environmental Remediation， Dalian Maritime University， Dalian 116026； 2.Institute of

Environmental Electrical Engineering， Dalian University of Technology， Dalian 116023）Abstract：At present， the methods to evaluate antibacteria property of textiles are different at home and abroad. There are no recognized and unified testing standards for different textiles. In order to ensure the accuracy of test results， appropriate test methods should be chosen to test magnesiumbased antibacterial fabric. Improved AATCC100 and improved oscillation method were applied to test antibacterium capability of magnesiumbased antibacterial fabrics for E.coli and Staphylococcus aureus. The results show that the bacteriostatic rate of the magnesiumbased antibacterial fabrics for the two kinds of bacteria is above 90%. And the results and conclusions gained by both methods are similar. The magnesiumbased antibacterial fabrics have obvious antibacterial effect on E.coli and Staphylococcus aureus.

Key words：magnesiumbased antibacterial fabrics； test criteria； improved AATCC100； improved oscillation method； bacteriostatic rate

通信作者：朱益民，Email：ntp@dlmu.edu.cn镁基抗菌织物是通过浸轧、涂层的方式将氢氧化镁附着于织物表面而形成的一种环境友好型抗菌织物。Mg（OH）2对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有良好的抗菌特性[1]。其抗菌主要通过ROS氧化损伤机理，即Mg（OH）2离解出过氧负离子（O-2），O-2有强氧化性，可以氧化细胞组分及蛋白质等[2]。另外，Mg（OH）2的表面由于包覆一层OH-而呈碱性，而O-2在碱性环境中具有较高的化学稳定性，因此产生的O-2容易在其表面富集，使其表面的O-2浓度较高，阻碍了细胞正常的物质交换过程，从而导致细胞死亡[35]。

近几年国内外市场研制并生产了大量的抗菌织物产品，然而产品质量良莠不齐，因此如何正确的检测并评价出这些产品的抗菌性能，促进功能性纺织品市场良好的发展和保障消费者权益就显得尤为重要。对目前国内外使用纺织品抗菌性能测试方法进行深入分析，测试思路有两种，第一种是试样法，即将菌液滴加到试样上，一段时间内在试样上直接进行抗菌过程，然后通过比较试样处理前后洗脱液培养的菌落数、pH值、颜色等参数衡量织物的抗菌性能。第二种是菌液法，即将试样置于菌液中，一段时间内在菌液体系中进行抗菌过程，通过比较处理前后菌液的相关参数如OD值的变化来评价织物的抗菌性能。由上可知抗菌纺织品的测试原理主要分两步，一是菌体与织物的接触过程，即织物抗菌过程；一是检测活菌过程。

国内外针对纺织品抗菌性能的检测方法有很多，定性测试方法主要有美国AATCC 90（晕圈法或琼脂平皿法）[6]、美国AATCC30试验法[7]、日本JISZ 2911抗霉菌试验法、中国GB/T 20944.1—2007《纺织品抗菌性能的评价第一部分：琼脂平皿扩散法》[8]等。定性实验是通过抗菌剂离开纤维进入培养皿后对菌体的抗性作用，一般适用于溶出型抗菌织物，而不适用于非溶出型抗菌织物，优点是费用低，检测速度快，但实验结果只能定性判断织物是否具备抗菌性能，不能准确给出抗菌率。定量测试的方法主要有美国AATCC100[9]、美国材料协会ASTM E2149试验法振荡法[10]、日本JIS LI902—2008[11]、中国FZ/T 01021—1992《织物抗菌性能实验方法》[12]、改良奎因法（Quinn）实验法[13]、GB/T 20944.3—2008《纺织品抗菌性能的评价第三部分：振荡法》[14]、GB/T 209944.2—2008《纺织品抗菌性能的评价第二部分：吸收法》等[15]。其中AATCC100和振荡法是目前应用的主要方法，这几种方法均适用于溶出型和非溶出型织物，并且可以定量、准确、客观的评价织物的抗菌性能。

AATCC100法在实验过程中存在的缺点：一次检验样少；非溶出型试样不能进行抗菌性能的评价；中和液成分不详细；容器过大，不易操作；菌液中营养过于丰富，与织物实际应用情况不符[16]。本研究对以上缺点加以改进，可以满足不同类型抗菌织物的性能测试。

振荡法可以适用于大多数试样，如毛羽类衣物、粉末状、表面凹凸不平的织物、非溶出型织物等[17]。但该法的缺点是培养液中缺乏菌体生长必须的营养物质，得到的抗菌率不精准；培养时间短，菌体几乎不增殖，与实际使用情况不符；振荡培养的温度只有25 ℃，达不到菌体生长最适温度[18]。

根据以上国内外测试方法和测试原理，本研究采用改良AATCC100和改良振荡法对镁基抗菌织物抗菌性能进行测试，使培养温度更适合菌体生长，培养时间充分，操作方法简单易行，菌种选用更符合实际应用。

1实验

1.1实验菌种

实验采用大肠杆菌（8099）和金黄色葡萄球菌（CTCC 10384），菌种来自中国普通工业微生物菌种保藏中心。

1.2实验材料

镁基抗菌织物PET3C、COTT1、COTT2；空白对照织物：涤纶、纯棉白坯布。

1.3实验设备

实验所用到的设备如表1所示。

1.4实验方法

1.4.1接种菌液制备

从第3～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物上取一环细菌，在0.5%的LB培养基中培养20～24 h，培养温度为（37±1）℃。取300 μL活化菌悬液加入30 mL的LB培养基中，培养8 h后，用0.85%生理盐水作为缓冲溶液稀释菌液以达到所需浓度。

1.4.2改良AATCC100法

实验过程：在超净工作台上将接种液用0.85%生理盐水进行稀释，用平板菌落计数法将菌液浓度确定为1×105～2×105 cfu/mL。

将空白对照织物、镁基抗菌织物各取边长为1.8 cm的正方形试样3份，每份的试样数量以能够完全吸收1 mL菌液为限，分别用纸巾包好置于高压灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min。将所有待测样品分别放置在已灭菌的培养皿中，移液枪吸取1 mL菌液均匀、完全的接种在各试样上，并在每个培养皿中放置一块吸饱和生理盐水的灭菌脱脂棉，以保持湿润的生长环境，（37±1）℃恒温培养。接触抗菌24 h后对试样用20 mL，0.85%的生理盐水进行菌体洗脱。将洗脱液采用10倍稀释法，每次取100 μL进行平皿涂布，（37±1）℃恒温培养24 h后，用平板菌落计数法进行计数。用式（1）计算试样的抑菌活性：

抑菌率/%=Xa-XbXa×100（1）

式中：Xa—培养24 h后空白对照样活菌数，cfu/mL；Xb—培养24 h后试样活菌数，cfu/mL。

遵循AATCC100的测试原理，改良AATCC100法较AATCC100主要从以下几个方面做了实验改进：a）将试样直径4.8 cm的圆形改为边长为1.8 cm的正方形，便于接种菌液时能够准确的确定完全吸收接种液的试样数量；b）用（37±1） ℃的0.85%生理盐水代替AATCC100中的肉汤接种液，避免菌液中的营养过多与实际应用条件相差较大，并将菌液稀释为1×105～2×105 cfu/mL；c）在洗脱试样时，为了避免洗脱液成分与菌液生长的营养环境差异较大而引起细菌数目的增多或减少，用20 mL，（37±1） ℃的0.85%生理盐水代替成份不明确的洗脱液洗涤试样；d）试样不在锥形瓶接种菌液，而是放入100 mm×15 mm的无菌培养皿中接种菌液，这样既避免了在转移试样的过程中染菌，同时也方便了实验操作；e）接菌后培养皿中放入一块饱含生理盐水的脱脂棉，保持菌体生长环境湿润，保温箱保温培养18～24 h。

1.4.3改良振荡法

实验过程：将所有试样剪成边长1 cm的正方形，称取0.75 g放入250 mL的带塞烧瓶中，每一试样称取3组平行样，121 ℃灭菌20 min备用。

将制备的菌悬液浓度用0.03%的磷酸缓冲溶液调至1×104～3×104 cfu/mL。取1 mL稀释好的菌悬液和50 mL 1‰的磷酸盐肉汤稀释液于灭菌的烧瓶中，空白对照样立刻在250～300 r/min条件下振荡1 min，然后取100 μL进行涂平板，（37±1）℃恒温培养箱中培养24 h，用平板菌落计数法进行计数，结果记为“0”接触时间烧瓶内活菌浓度。

然后将剩余烧瓶放入恒温培养振荡器中，（37±1）℃，120 r/min，培養（20±2）h。采用0.85%的生理盐水将菌液按10倍稀释法进行稀释，每次取100 μL进行涂平板，然后放置于恒温培养箱中，（37±1）℃，培养18 h，计算菌落数，结果记为培养后的细菌数。

根据式（2）计算试验菌的增长值F，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌，当F值大于或等于1.5，且空白对照烧瓶中的活菌浓度比接种时的活菌浓度增加时，试验判定为有效，否则无效。

F=lgA-lgB（2）

式中：F—对照样的试验菌增长值；A—3个空白对照样接种并培养18 h后的细菌平均值cfu/mL；B—3个空白对照样“0”接触时间烧瓶内活菌浓度平均值，cfu/mL。

根据式（3）计算恒温振荡培养18 h后抗菌织物抑菌率。

抑菌率/%= （A-C）/A×100（3）

式中：C—3个抗菌织物试样接种并培养18 h后测得烧瓶内活菌浓度平均值，cfu/mL。

改良振荡法结合FZ/T 73023、GB/T 20944.3和AATCC100的优点，在实验方法上做出如下改进：a）将振荡培养温度由FZ/T 73023、GB/T 20944.3中的（24±1）℃改为细菌生长的最适温度（37±1）℃；b）对比FZ/T 73023、GB/T 20944.3，在菌液浓度相同的条件下，改良振荡法中将原有的5 mL接菌液和70 mL振荡液改为1 mL接菌液和50 mL振荡液，使实验操作更简便；c）振荡时间由GB/T 20944.3中的18 h延长到（20±2） h，以使抗菌织物中的抗菌剂完全释放出来；d）为了避免菌体随着振荡时间的延长而缺乏营养死亡，将磷酸盐缓冲溶液改为1‰磷酸盐肉汤稀释液；e）将振荡培养的速度由150 r/min变为120 r/min，避免振荡的速度过快导致菌体死亡。

2結果与讨论

2.1镁基抗菌织物对大肠杆菌和金黄色葡

萄球菌的抗菌性能测试结果采用改良AATCC100法和改良振荡法测试镁基抗菌织物对大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC 6538的抑菌实验，结果如表2、表3所示。由表2、表3可以看出，改良AATCC100法中，3种镁基抗菌织物对大肠杆菌的抗菌率为97.1%、95.2%、95.7%，抗菌率均在90%以上；在改良振荡法的实验中，经试验验证，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌增长值≥1.5，3种镁基抗菌织物对大肠杆菌的抑菌率为96.9%、94.7%、91.9%，镁基抗菌织物的抑菌效果较强；改良振荡法实验结果与改良AATCC100法的实验结果基本相近，可知两种方法得到的实验结果可靠。

2.2影响镁基抗菌织物抗菌性能测试的关

键因素2.2.1菌液制备

菌液制备为抗菌性能检测实验的初始步骤，菌液的质量和浓度直接影响到实验结果的准确性和可靠性。在实验过程中，只有活性最高，形态最稳定的菌体，对抗菌织物性能的检测才最具有代表性。目前国内外的制备方法中主要分为两步法和三步法，所谓的两步法为：第一步，用接种环接种保藏菌种，划线接种于营养琼脂培养皿中，将平皿置于37 ℃培养箱中培养一段时间；第二步，从第一步的平皿中接种一菌环细菌于液态培养基中，37 ℃下培养一段时间，并将菌液浓度稀释至规定浓度。三步法是取第二步中的原菌液于液态培养基中，37 ℃下培养一段时间，最后将菌液浓度稀释至规定浓度。本次实验采用三步法制备菌液。采用三步法的优点是较两步法大大提高了菌液的活性，尤其对于活性较差的金黄色葡萄球菌，菌液质量有明显提高，但对活性较高的大肠杆菌来说变化不大[19]。

由于菌体繁殖会使培养液浑浊，菌悬液的细胞浓度与OD值成正比，用分光光度计测出浊度，用OD值表示菌液浓度。通过特性数学分析方法得出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最优生长活性时间点。

由图1可知，大肠杆菌培养液的OD值随着时间的延长呈S型曲线生长，在9 h时，细胞呈对数形式增长，此时的细胞大小、形态、生理特征等都较为一致，生长代谢十分旺盛，是制备接种菌液的良好时期。

图1大肠杆菌接种培养时间与OD值之间的关系

由图2可知，金黄色葡萄球菌培养液浓度在前3 h内增长缓慢，由于菌体对生长环境较为敏感，该段时间内菌体细胞基本不增殖；3～12 h之间金黄色葡萄球菌菌液OD值迅速增长，其中在7～8 h附近，曲线斜率达到最大，由此可知金黄色葡萄球菌从3 h开始迅速生长，在7～8 h之间，菌体生长速度达到最大值，细胞代谢最旺盛，繁殖能力最强，形态也较为稳定，所以选择培养7～8 h的金黄色葡萄球菌为接种菌能充分体现出抗菌织物的抗菌特性。图2金黄色葡萄球菌接种时间与OD值之间的关系

2.2.2改良AATCC100法中接菌试样大小与数量

在AATCC100法中，试样切成直径为（4.8±0.1）cm的圆形，将样品堆叠在250 mL带有螺旋盖的广口瓶中，用于旋加1.0 mL的接种液，然后将试样转移到带盖的广口瓶内恒温保存。样品的数量以完全吸收1 mL菌液为限。该方法在实验操作过程中，由于试样面积较大，难以准确的控制吸收1 mL菌液的试样数量，并且在接种后转移试样于广口瓶的过程中易染菌，试样易贴壁。为避免以上问题，在改良AATCC100法中，将试样的大小变为1.8 cm，于无菌平皿中接菌1 mL，然后直接在平皿中放入饱含生理盐水的无菌脱脂棉团。改进后的操作步骤可以更加灵活的调整试样的数量，并且减少了试样贴壁造成的菌液减少。

2.2.3洗脱液制备

在AATCC100法中，试样接种培养一段时间后进行振荡洗脱，以将试样表面剩余活菌洗脱下来。洗脱液营养成分应与试样实际使用环境相近，并在振荡过程中使菌体完全洗脱，洗脱液里菌体分散均匀，才能保证菌落计数时的准确性。在改良AATCC100中，使用37 ℃的0.85%生理盐水作为洗脱液。洗脱液制备的过程中，要对浸渍在0.85%的生理盐水中的织物充分振荡3～5 min，反复操作振荡步骤3次，保证每次振荡力度相同。

3结论

a）改良AATCC100法和改良振荡法是检测织物抗菌特性的具有代表性的两类方法，相对于AATCC100和振荡法，实验参数更加合理。

b）镁基抗菌织物作为环境友好型材料，具备良好的抑菌特性。3种镁基抗菌织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到90%以上。

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