植物原生质体PEG—高Ca2+—高pH融合法的研究

李琦

文章编号： 1005-2690（2018）07-0082-02 中图分类号： Q943 文献标志码： B

摘 要：植物原生质体融合技术可打破物种生殖隔离障碍，实现基因在物种间的转移和遗传重组，创造出具有亲本优良性状的远缘杂交物种。对于植物原生质体融合来说，PEG-高Ca2+-高pH融合法可使原生质体达到理想的融合效果，对植物培养有重要意义。主要介绍了PEG-高Ca2+-高pH融合法，为植物原生质体融合的研究发展提供基础资料。

关键词：原生质体；PEG-高Ca2+-高pH融合法；研究

在培养物中加入聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可促使植物原生质体融合，而原生质体处于高pH高Ca2+的条件下也能促使原生质体融合。后来凯勒（Keller）发现了PEG-高Ca2+-高pH融合法。经试验发现，PEG-高Ca2+-高pH融合法促进原生质体融合的效率较PEG融合法更加理想。

1 PEG-高Ca2+-高pH融合法的研究发现

1973年，Keller[1]在诱导烟草原生质体时发现，原生质体在高pH高Ca2+的条件下可发生融合。在多数试验中发现，使用这一融合方法可使20%～50%的原生质体发生融合。1974年，Keller等发现，用含有高浓度Ca2+（7.35 g/L CaCl2·2H20）的强碱性溶液（pH值为9～10）清洗PEG时，原生质体融合的效果要比用培养基清洗高很多，因此将PEG融合法与高pH高Ca2+法结合在一起，建立了PEG-高Ca2+-高pH融合法。

该法的主要操作步骤是：用适当的比例将两种不同的原生质体进行混合，使其形成小滴状，在小滴状的原生质体上及其周围加上PEG溶液，使原生质体粘连融合；用高pH高Ca2+溶液清洗PEG，最后用培养基清洗，去高pH高Ca2+溶液。后来有学者对该法进行了改良[2]，将原生质体悬浮液滴入盖玻片或离心管中，静置使其形成薄层原生质体后，加入20%～40%的PEG 6 000、40%蔗糖、1.47 g/L CaCl2等融合液处理，经离心洗涤后培养，最后在固体平板培养基上培养。也有学者[3]或对钙溶液进行替换，或对PEG进行改良，或对操作步骤进行改进，都获得了融合原生质体。

2 PEG-高Ca2+-高pH融合法的作用机理

PEG是一种高分子化合物，含有醚键而具有负极性，可与蛋白质、水、碳水化合物等一些正极化基团形成氢键，PEG带有大量的负电荷，也可与水之间形成氢键。因此，PEG与水、蛋白质、碳水化合物之间的氢键相结合，使溶液中自由水消失，植物细胞由于高度脱水使原生质体发生凝集，形成大小不一的凝集物，促进原生质体连接更加紧密。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。同时由于PEG的负极性，能够结合Ca2+与原生质体表面的负电荷形成静电键，加强原生质体粘连和结合。

洗涤的过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱下来，引起电荷的紊乱和再分布，也可能是被剥去蛋白质相邻细胞膜类脂质间的反应，产生了变化与重排，导致细胞膜局部融合，形成小的细胞质桥，进而发生两个原生质体的融合。高Ca2+与高pH环境的存在，加剧了电荷的不稳定性，促使重排的快速进行，增加了质膜的流动性，提高了融合效率。冲洗时产生的渗透和碰撞冲击，也有可能促进融合的发生。但需要注意的是，PEG对细胞有一定的毒性作用，其相对分子质量越大，毒性越强。

3 影响PEG-高Ca2+-高pH融合法的因素

3.1 PEG的相对分子质量

一般所用的PEG相对分子质量为1 000～6 000，PEG分子量大于1 000时，才能诱导原生质体达到紧密的粘连和较为理想的融合效果，不同种类的原生质体对PEG分子量的要求不同。

3.2 PEG的浓度及处理时间

PEG的浓度较低或处理时间过短，会导致融合效果不理想；浓度过高或处理时间过长，会造成PEG对原生质体的毒害作用增强，可能造成原生质体的活性丧失，或减少异核体的融合率。

3.3 原生质体的生理状况和密度

应选择生理活性较高的原生质体进行融合，原生质体密度过高或过低都不利于原生质体的融合。密度低，融合效率较低；密度高，则会出现多重融合现象，导致双核异质体含量减少，达不到预期的试验和生产效果。一般原生质体的浓度要达到106～108个/mL。

3.4 原生质体的选择及材料的预处理

沈前华等研究证明，双子叶植物的叶片是原生质体的最佳材料，另外，愈伤组织、外植体和细胞悬浮物也常是原生质体的培养材料。有试验表明，对植物材料预处理后的原生质体分离效率更高，且两种原生质体的外观最好选用易于区分的。

3.5 温度

适当的高温能提高融合效率，一般在20～30 ℃条

件下处理1～10 min。有试验证明，在35～37 ℃条件下，特别有利于高度液泡化的原生质体融合。

3.6 PEG的清洗

应按一定的步骤进行，切勿剧烈清洗，易使异核体数目减少，原生质体遭到物理性破坏。

3.7 选择配制合适的培养基

培养基内营养物的含量、pH值、渗透压、激素的种类和比例等都根据不同植物原生质体的种类不同而有一定的差异。

参考文献：

[ 1 ] Keller W A & Melchers G.Effect of high pH and calcium on

tobacco leaf protoplast fusion[J]. Z.Nalurforsch.C，1973（28）：

737-741.

[ 2 ] 鞏振辉，申书兴.植物组织培养[M].北京：

化学工业出版社，2013.

[ 3 ] 黄国文.野燕麦原生质体制备和融合的

研究[J].安徽农业科学，2013，41（23）：

9 546-9 547.

（收稿日期：2018-06-08）