碎米蛋白提取及高剪切辅助酶法改善其溶解性研究

祝水兰 刘光宪 周巾英 冯健雄

摘要：【目的】研究碎米蛋白提取，并通过改性提高碎米蛋白溶解性的关键技术，为解决优质蛋白缺乏问题提供技术参考。【方法】以早籼碎米为原料，采用单因素试验与正交试验相结合的方法，分别以蛋白提取率和蛋白溶解度为考察指标，确定超声波辅助碱法提取碎米蛋白及高剪切辅助酶法改善其溶解性的最佳方案。【结果】提取碎米蛋白的最佳工艺：NaOH质量浓度0.4%、固液比1：8（g/mL）、提取时间2 h，碎米蛋白提取率为70.79%，各因素对碎米蛋白提取率的影响排序为NaOH质量浓度>提取时间>固液比；提高蛋白溶解性的最佳工艺：剪切转速3500 r/min、剪切时间30 min、剪切温度45 ℃、加酶量1.5%，碎米蛋白溶解度由0.53%提高至28.00%，各因素对碎米蛋白溶解性的影响排序为剪切转速>剪切时间>剪切温度>加酶量。【结论】超声波与碱法联用可提高碎米蛋白提取率，高剪切辅助酶法可提高碎米蛋白溶解性。

关键词： 碎米；蛋白；超声波；高剪切；提取率；溶解度

中图分类号： S511.21 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1403-06

0 引言

【研究意义】大米中蛋白含量虽然不高，却是一种优质蛋白（王章存等，2006）。大米蛋白的氨基酸构成比较完整，是禾谷类粮食中最好的一种蛋白（易翠平和姚惠源，2003），属于低抗原性蛋白，不会产生过敏反应，且具有许多潜在的保健功能，如抗癌变、抗胆固醇和抗糖尿病等（王章存等，2004；郭艳和曾里，2010）。大米蛋白主要成分是谷蛋白，谷蛋白分子量大，分子内和分子间存在大量巯基和二硫键，这些结构特性使得大米蛋白在中性条件下难溶于水，而严重影响其在食品工业中的应用，因此改善大米蛋白的溶解性是解决其应用问题的关键（肖莲荣和任国谱，2012）。【前人研究进展】目前常见的大米蛋白分离提取方法有碱法提取、酶法提取、分步水解法、复合提取法和物理分离法等（李超楠等，2017b）。陈季旺等（2006）采用碱酶两步法制备大米蛋白，得到蛋白提取率73.22%，纯度88.75%。万娟等（2009）采用碱法从籼碎米中制备提取大米蛋白，在氢氧化钠（NaOH）质量浓度0.09 mol/L、料液比1∶6、提取温度25 ℃的条件下提取4 h，得到大米蛋白提取率77.3%，蛋白质纯度80.5%。王章存等（2012）研究高压处理对大米蛋白溶解性的影响，结果表明，在pH 10.0的条件下500 MPa高压处理可使大米蛋白的溶解度由16.60%提高到24.87%。朱建华等（2012）利用中性蛋白酶对稻谷加工副产物进行了碎米蛋白提取研究，蛋白提取率可达74.8%。杨桦（2017）利用超声波辅助酶法技术提取小米蛋白，得到小米蛋白提取率为（74.26±1.20）%，但酶法提取成本较高。【本研究切入点】目前，尚无利用超声波与碱法联用提取碎米蛋白和采用高剪切与酶法结合处理改善碎米蛋白溶解性的研究报道。【拟解决的关键问题】以早籼稻米加工副产物碎米为原料，采用超声波与碱法联用技术提取蛋白，并通过高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解性，以提高碎米的附加值，并为解决优质蛋白缺乏问题提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

早籼碎米为农户售，粉碎成粒度200 μm，水含量5.92%，蛋白质含量8.85%，碎米蛋白初始溶解度0.53%，色泽气味正常。NaOH、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、甲基红指示液、溴甲酚绿指示剂和乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司，碱性蛋白酶（酶活力200000 U/g）购自江苏锐阳生物科技有限公司。主要仪器设备：高速组织捣碎机JJ-2（2003-61）（常州亿通分析仪器制造有限公司）、粉碎机XL-200A（上海润实电器有限公司）、分析天平TP-214（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、超声波细胞粉碎仪UP250（宁波新芝生物科技股份有限公司）、水浴恒温振荡器SHA-B型（常州润华电器有限公司）、雷磁PHS-3C（上海仪电科学仪器股份有限公司）、高剪切乳化机SGR4011（上海尚贵流体设备有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 工艺流程

1. 2. 1. 1 碎米蛋白提取 碎米→碾粉→碱调乳液→高速组织捣碎→负压吸胀→超声波细胞粉碎仪处理→离心→蛋白液→酸沉→干燥→粉碎→碎米蛋白。

1. 2. 1. 2 高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解性

碎米蛋白粉→固液比调配→高剪切处理→取样→高速组织捣碎匀浆→负压→超声波处理→调pH至8.5→预热→碱性蛋白酶酶解→90 ℃水浴滅酶10 min→冷却→离心4000 r/min→取上清液备用。

1. 2. 2 碎米蛋白提取工艺优化

1. 2. 2. 1 单因素试验 以碎米蛋白提取率为指标，分别考察NaOH质量浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）、提取时间（1、2、3、4和5 h）和固液比（每体积质量计）[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12（g/mL）]3个因素对碎米蛋白提取率的影响。进行3次重复试验。

1. 2. 2. 2 正交试验 碎米蛋白提取率受NaOH质量浓度、提取时间和固液比的影响，根据单因素试验的结果，碎米蛋白提取进行3因素3水平正交试验（表1），以碎米蛋白提取率为考察指标，进行3次重复试验。

1. 2. 3 高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解性研究

1. 2. 3. 1 单因素试验 取1.2.2碱法提取的蛋白，粉碎，称50 g溶于4000 mL去离子水中，配成蛋白溶液，转入高剪切乳化机中，在一定剪切转速（1500、2000、2500、3000、3500和4000 r/min）、剪切温度（35、40、45、50和55 ℃）、剪切时间（20、30、40、50和60 min）和加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）条件下按1.2.1.2工艺流程试验，对比分析这4个因素对碎米蛋白溶解性的影响。进行3次重复试验。

1. 2. 3. 2 正交试验 由于碎米蛋白溶解度受剪切转速、剪切温度、剪切时间及加酶量的影响，根据单因素试验的结果，高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解性研究进行4因素3水平正交试验（表2），以碎米蛋白溶解度为考察指标，进行3次重复试验。

1. 3 指标测定

蛋白质含量参照GB 5009.5—2016凯氏定氮法进行测定；蛋白溶解度参照郑芳燕等（2010）的方法进行测定，将碎米蛋白溶液置于30 ℃水浴振荡器中，以120 r/min搅拌2 h后静置数分钟，取上清液于4000 r/min离心分离10 min，再取离心上清液测蛋白质含量。蛋白提取率（%）=样品中蛋白质含量/原料中蛋白质含量×100，蛋白溶解度（%）=上清液蛋白质含量/样品中蛋白质含量×100。

1. 4 统计分析

采用Excel 2007对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 碱法提取蛋白质试验结果

2. 1. 1 单因素试验结果

2. 1. 1. 1 不同NaOH质量浓度对碎米蛋白提取率的影响 由图1可知，随着NaOH质量浓度的不断升高，碎米蛋白提取率先升高后下降，当NaOH质量浓度为0.4%时，蛋白提取率达最大值（67.88%）。大米蛋白在胚乳中与淀粉结合紧密，较难溶出，NaOH能有效提高蛋白溶解性，因为大米蛋白中含有80%左右的谷蛋白，而谷蛋白属碱溶性（刘深勇，2015），当NaOH质量浓度低时，碱能使碎米淀粉和蛋白分离（郭梅等，2011）；当碱浓度超过0.4%后，由于淀粉部分糊化，使溶液黏度增加，导致蛋白无法被提取出来，蛋白提取率下降。因此碱浓度选择0.4%左右为宜。

2. 1. 1. 2 提取时间对碎米蛋白提取率的影响 由图2可知，提取开始后，碎米蛋白提取率随提取时间的延长而增加，此时溶出的蛋白较多，淀粉结构松散。当提取时间超过2 h后，随着提取时间的延长，蛋白提取率下降，是由于淀粉的松散程度大，离心上清液中蛋白质含量减少，导致蛋白提取率有所下降。因此，选择提取时间2 h为宜。

2. 1. 1. 3 固液比对碎米蛋白提取率的影响 由图3可知，随着提取溶液体积的增加，蛋白提取率不断上升，当固液比为1：8时，蛋白提取率达最大值（69.18%），是由于随着提取溶液体积的增加，碎米蛋白更易溶解于上清液中，使碎米蛋白更易分解。为了节约成本，选取固液比为1∶8。

2. 1. 2 L9（33）正交试验结果 由表3可知，蛋白提取工艺中，影响碎米蛋白提取率的因素排序为A>B>C；从空列的R来看，可能存在比固液比对碎米蛋白提取率影响更大的因素。最佳工艺组合为A3B2C1，即NaOH质量浓度0.4%、提取时间2 h、固液比1∶8，在此条件下得到碎米蛋白提取率为70.79%。

2. 2 高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解性试验结果

2. 2. 1 单因素试验结果

2. 2. 1. 1 剪切转速对碎米蛋白溶解性的影响 由图4可知，随着剪切转速的增加，蛋白溶解度逐渐增加。高剪切作用可对蛋白质颗粒产生强烈的剪切、拉伸和挤压，使蛋白质颗粒发生破裂，粒径变小，表面积增大（张彩猛等，2010），有效提高碎米蛋白的溶解度。当剪切转速达3500 r/min时，蛋白溶解度趋缓，因此选择剪切转速为3500 r/min。

2. 2. 1. 2 剪切温度对碎米蛋白溶解性的影响 由图5可知，温度可提高碎米蛋白的溶解度，隨着剪切温度的升高，碎米蛋白溶解度逐渐升高。这主要是因为蛋白质的结构紧密，进行适当的加热处理，蛋白质出现离解和开链现象，破坏了不溶性蛋白间的作用力，从而改进了蛋白质的水合能力，提高其溶解性。当剪切温度达50 ℃时，溶解度趋缓，故选择剪切温度为50 ℃。

2. 2. 1. 3 剪切时间对碎米蛋白溶解性的影响 由图6可知，碎米蛋白溶解度在开始剪切30 min内，随着剪切时间的延长而逐渐增大，在剪切30 min后，蛋白溶解度开始下降。其原因可能是当蛋白颗粒的粒径小到一定程度时，受到剪切作用力变弱，表面可溶性蛋白溶解性逐渐降低。因此，选择30 min为最佳剪切时间。

2. 2. 1. 4 加酶量对碎米蛋白溶解性的影响 由图7可知，碎米蛋白剪切后加入碱性蛋白酶能提高碎米蛋白的溶解度，加酶量为0.5%～1.5%时，碎米蛋白溶解度随着加酶量的增加而逐渐增大，当加酶量超过1.5%后，溶解度有所下降。这是由于酶的水解作用使碎米蛋白分子的一些亲水基团释放出来，从而提高其溶解度；但随着酶浓度的增加，蛋白分子易产生交联聚合现象，从而使蛋白溶解度呈下降趋势。因此，选择1.5%为最佳加酶量。

2. 2. 2 L9（34）正交试验结果 由表4可知，高剪切与酶法结合改善碎米蛋白溶解度工艺中，影响蛋白溶解度的主次因素依次为A>C>B>D，最佳工艺组合为A3B2C1D3，即剪切转速3500 r/min、剪切温度45 ℃、剪切时间30 min、加酶量1.5%。最优组合在试验设计组合中，碎米蛋白溶解度为28.00%。

3 讨论

目前已有不少提取大米蛋白的研究，如奚海燕等（2007）使用碱酶两步法从米粉中提取大米蛋白，碱法工艺中蛋白提取率为51.30%；朱建华等（2013）采用高功率超声波技术提取可溶性蛋白，在超声波功率495 W条件下蛋白提取率达90.47%；李超楠等（2017a）使用KQ-500DE型超声清洗机辅助提取碎米蛋白，提取率为67.01%。本研究利用低功率超声波细胞粉碎机（最大功率250 W）辅助碱法提取碎米蛋白，在NaoH质量浓度0.4%、提取时间2 h、固液比1∶8的条件下蛋白提取率达70.79%，说明低功率超声波更有利于提高蛋白提取率。超声波细胞粉碎机是一种利用强超声在液体中产生空化效应，可使蛋白质破碎、乳化、分离、匀化及加速化学反应等，从而使蛋白质颗粒进一步细化，与碎米淀粉的连接产生松动，提高其提取率。

黃建韶和张洪（2014）使用浓度为1200 U/g的Alcalase蛋白酶水解大米蛋白，大米蛋白的溶解度达71.25%，但蛋白酶用量多，价格高；聂小华等（2015）采用HCl对大米蛋白进行脱酰胺处理，脱酰胺处理4 h的大米蛋白溶解性约提高了7.86倍；万红霞等（2015）采用动态超高压微射流进行均质处理，大米蛋白溶液的溶解性显著提高。本研究利用高剪切乳化设备与酶法结合对碎米蛋白进行高剪切处理，在剪切转速3500 r/min、剪切时间30 min、剪切温度45 ℃、加酶量1.5%的条件下，碎米蛋白溶解度由0.53%提高到28.00%。蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，能够将蛋白分子的肽链水解断裂，提高蛋白溶解性，但本研究使用的是碱性蛋白酶处理，蛋白质易溶于碱性溶液中，蛋白质被酶解，溶解性降低。高剪切乳化机具备了细化、分散和均质的功能，主要利用高剪切均质机定转子间相对高速运动产生的高剪切作用，同时伴随着较强的空穴作用对蛋白质颗粒进行分散、细化、均质，提高蛋白溶解性，对促进溶解性要求高的产品生产具有重要意义，但溶解性还有待进一步提高。为了拓展蛋白的应用领域，今后可对蛋白的乳化性、起泡性和成膜性等物理特性及使用其他酶来提高蛋白溶解性进行深入研究。

4 结论

结合单因素试验和正交试验得到超声波与碱法联用提取碎米蛋白的工艺条件：NaOH质量浓度0.4%、固液比1∶8、提取时间2 h，碎米蛋白提取率达70.79%；得到高剪切辅助酶法提高碎米蛋白溶解性的工艺条件：剪切转速3500 r/min、剪切时间30 min、剪切温度45 ℃、加酶量1.5%，碎米蛋白溶解度由0.53%提高到28.00%。超声波与碱法联用可提高碎米蛋白提取率，高剪切辅助酶法可提高碎米蛋白溶解性。

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（责任编辑 罗 丽）