黄芪—当归配伍对大鼠血管内膜增生模型细胞外基质的影响

彭熙炜　阎卉芳　黄娟　朱嘉欢　徐昊　黄小平　邓常清

〔摘要〕 目的 研究黃芪和当归配伍对大鼠血管内膜增生血管壁细胞外基质的影响。方法 将SD大鼠随机分为黄芪与当归（简称芪归）1∶1、芪归5∶1（3.9 g/kg）配伍组及单用黄芪组（2.17 g/kg）、单用当归组（1.08 g/kg）、阳性药物阿托伐他汀对照组（0.1 g/kg）和假手术组，采用球囊导管损伤大鼠血管内皮造成胸腹主动脉血管内膜增生模型，同时灌胃黄芪、当归不同比例配伍药物，连续给药14 d后，取胸腹主动脉，用western blot法检测增生内膜中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表达，免疫组化法检测增生内膜中Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、纤维联接蛋白（FN）表达。结果 与模型组比较，单用当归组、芪归1∶1组、阿托伐他汀组Col-Ⅰ、FN、MMP-9表达显著降低（P<0.01，P<0.05）。芪归5∶1组Col-Ⅰ、MMP-9表达强度显著低于模型组（P<0.05）；单用黄芪组MMP-9表达强度显著低于模型组（P<0.05）。单用黄芪组Col-Ⅰ、FN的表达强度与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），芪归5∶1组FN的表达强度与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。各组间TIMP的表达强度差异无统计学意义（P>0.05）。结论 黄芪-当归配伍可抑制血管内膜增生时血管壁细胞外基质沉积，其中当归为其主要的效应药物，黄芪-当归1∶1配伍的作用强于两药单用及其5∶1配伍。

〔关键词〕 黄芪；当归；配伍；血管内膜增生；细胞外基质

〔中图分类号〕R285.5；R393；R54 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.005

〔Abstract〕 Objective To study the effect of compatibility of Astragali Radix （Huangqi） and Angelicae Sinensis Radix （Danggui） on the extracellular matrix of rats with intima hyperplasia. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into different groups： Huangqi-Danggui 1∶1 group， Huangqi-Danggui 5∶1 group （3.9 g/kg）， Huangqi group （2.17 g/kg）， Danggui group （1.08 g/kg）， atorvastatin control group （0.1g/kg） and sham-operation group. A model of intimal hyperplasia of thoracoabdominal aorta was established by balloon catheter injury in rats. Then thoracoabdominal aorta was taken out after administration of Huangqi and Danggui for 14 days. The expression of matrix metallopeptidase-9 （MMP-9） and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 （TIMP-1） in proliferating endometrium was detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of collagen-Ⅰ（Col-Ⅰ） and fibronectin （FN） in proliferative endometrium. Results Compared with the model group， the expression intensity of Col-Ⅰ， FN and MMP-9 in Danggui group， Danggui-Huangqi 1∶1 group， atorvastatin group were significantly lower （P<0.01， P<0.05）. The expression of Col-I and MMP-9 in Danggui-Huangqi 5∶1 group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. The expression of MMP-9 in Danggui group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of Col-Ⅰand FN between the Danggui group and the model group （P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of FN between the Huangqi-Danggui 5∶1 group and the model group（P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of TIMP between each group（P>0.05）. Conclusion Huangqi and Danggui could inhibit the deposition of extracellular matrix during intimal hyperplasia. And Danggui is one of the main effect drugs. The effect of Huangqi-Danggui 1∶1 compatibility was stronger than the two drugs alone and compatibility of Huangqi-Danggui 5∶1.

〔Keywords〕 Astragali Radix； Angelicae Sinensis Radix； compatibility； vascular intimal hyperplasia； extracellular matrix

血管内膜增生是动脉粥样硬化、高血压血管重构和介入术后血管再狭窄等心血管疾病的病理生理基础。在其复杂的发病机制中，血管内皮损伤后导致血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）从血管中膜迁移到内膜并增殖是其病理生理基础。同时，VSMC在内膜迁移增殖过程中合成大量细胞外基质（extracellular matrix， ECM），沉积于血管壁，从而形成新生内膜，引起血管狭窄[1]。因此，抑制血管内皮损伤后VSMC增殖的同时，抑制ECM沉积和促进其降解，是防治血管内膜增生性病变的重要手段。

黄芪和当归是临床常用的中药药对，二者配伍既具有补气生血作用，又可益气活血。黄芪和当归的配伍（简称芪归）应用最有名的是公元1247年由李东垣所创的当归补血汤（Danggui Buxue Tang， DBT），由黄芪一两、当归二钱组成，芪归比为5∶1。研究表明，由黄芪和当归配伍组方除具有促进造血[2]、增强免疫力[3]等作用外，还具有心血管保护作用[4]、抗动脉粥样硬化[5]等药理效应。本课题组前期研究发现黄芪-当归在一定比例范围内配伍有较好的抗血管内膜增生的作用，而且当归为其抗血管内膜增生的主要药效物质。黄芪配伍当归可增强其抗血管内膜平生的作用，其中以芪归1∶1配伍的作用为强[6]，但其作用机制尚未阐明。因此，我们基于血管内膜增生的病理生理机制，以抑制ECM沉积为切入点，进一步探讨了黄芪和当归配伍抗血管内膜增生的作用机制。

1 实验材料

1.1 主要仪器

2.0 mm×15 mm Runjin医用球囊导管、Runthrough导丝（日本泰尔茂株式会社产品）。医用球囊扩张压力泵（江西省中医院提供）。

1.2 实验动物

SD雄性大鼠，体质量220～250 g，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，大鼠动物许可证号：SCXK（湘）2013-0004。实验前适应性饲养1周，饲养于湖南中医药大学实验动物中心，湿度45%～65%、室温25 ℃，喂食标准饲料，自由摄水。实验场地许可证号：SCXK（湘）2013-0005。

1.3 药物及制备

黄芪（产地内蒙古）、当归（产地甘肃）由湖南中医药大学附一医院药剂科统一购进并经湖南中医药大学附一医院左亚杰教授鉴定，黄芪为膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bunge的干燥根，当归是伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根。根据本课题组以前的研究结果，黄芪和当归在1∶1配伍时具有较好的抑制血管内膜增生的作用[6]，而黄芪和当归的传统配伍是5∶1，故设立黄芪-当归1∶1、5∶1配伍及单用药物组。按不同配伍，分别称取药材，以水热回流法提取3次（第一次8倍量水，提取1 h；第二、三次6倍量水，提取1 h），合并3次提取液，过滤后在60 ℃真空条件下蒸发浓缩制成浸膏，取出浸膏用蒸馏水定容为一定浓度：黄芪0.22 g/mL（生药）、当归0.11 g/mL（生药）、芪-归不同配伍组0.39 g/mL（生药）。药液中加入苯甲酸钠0.1%，分装后置-4 ℃冰箱中保存备用。阿托伐他汀钙，浙江新东港药业股份有限公司生产，批号：20160803，规格：10 mg/片。临用时用蒸馏水溶解制成混悬液。

1.4 主要试剂

兔抗大鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗体、兔抗大鼠组织基质金属蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）多克隆抗体、兔抗大鼠Ⅰ型胶原（Col-I）多克隆抗体、兔抗大鼠纤维联接蛋白（FN）多克隆抗体、β-actin多克隆抗体为英国abcam公司产品。DAB显色试剂盒（批号：SP-900D）、免疫组化染色试剂盒（批号：SP-9001）为北京中杉金桥生物有限公司产品。牛血清蛋白（BSA）为华美生物工程有限公司产品。PVDF膜为瑞典Amersham公司产品。ECL化学发光试剂盒为美国GE Healthcare公司产品。其它试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 实验分组及模型制备方法

将大鼠随机分为7组：假手术组、模型组、单用当归组、单用黄芪组、芪归1∶1组、芪归5∶1组、阿托伐他汀组。每组实验成功的大鼠数为8～10只。采用球囊损伤后血管再狭窄模型[7]。假手术组∶只分离暴露左颈总动脉后缝合，不进行球囊损伤术。术后灌服等量蒸馏水。模型组∶行胸腹主动脉球囊损伤造模，不进行药物干预。术后灌服等量蒸馏水。阿托伐他汀组∶胸腹主动脉球囊损伤术后灌服阿托伐他汀药液。芪归不同配比组∶胸腹主动脉球囊损伤术后灌服芪归不用配比药液。术后第一天开始给药，连续14 d后检测。给药剂量为∶单用当归组1.1 g/kg，单用黄芪组2.2 g/kg，芪归配伍组3.9 g/kg（芪归1∶1配伍为1.95 g/kg+1.95 g/kg，芪归5∶1配伍为3.25 g/kg+0.65 g/kg），阿托伐他汀组10 mg/kg。给药体积为10 mL/kg。

2.2 观察指标

2.2.1 标本的采集 末次给药后次日麻醉动物，截取胸腹主动脉血管。用于western blot检测的血管直接放入冻存管，然后置于-80 ℃冰箱保存。用于免疫组化检测的血管以4%多聚甲醛固定，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 免疫组织化学法测定增生内膜中FN、Col-I表达 以免疫组织化学法测定增生内膜中FN、Col-I的表达（一抗稀释倍数∶FN 1∶100，Col-I 1∶100），操作按说明书。光镜下可见阳性表达呈棕黄色点状或纤维状染色，集中在细胞膜、细胞浆或细胞间。阴性则无棕黄色染色。用MIAS医学图像分析系统拍照，再每张切片分别选取3个不同视野，用image-pro plus 6.0图像分析软件测量单位面积的阳性染色积分光密度（integrated optical density，IOD），取平均值进行统計分析。

2.2.3 western blot法測定MMP-9、TIMP-1蛋白表达 取出血管组织，剔除外膜结缔组织，尽量剪碎，加入1 mL的RIPA裂解液，2 μL PMSF，研磨至无明显的组织碎片，再置于冰上0.5 h后，将组织匀浆液移至1.5 mL的离心管中，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液。以BCA法测定样品的蛋白含量。按配方制备10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶，将凝胶转移至电泳槽。取样品蛋白，加入2×SDS loading buffer、β-巯基乙醇、裂解液调整蛋白浓度（1 μg/μL），置沸水中煮10 min使蛋白变性。将待分析样品和Marker依次加入，每个泳道加入20 μL。然后进行电泳。电泳完毕后，将凝胶放在电转液中，恒流20 mA转膜，4 ℃冰箱中过夜，使凝胶目的蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜用PBS液洗2次，然后放入5%PBS-脱脂奶粉封闭液内封闭90 min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入约1 mL一抗（MMP-9 1∶1 000， TIMP-l l∶1 000， β-actin 1∶1 000），在室温下摇床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。再将上述与一抗孵育的PVDF膜加入稀释的二抗（羊抗兔IgG 1∶1 000），在室温下摇床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。以ECL显色液显色，最后用凝胶成像系统观察、拍照。用Quantity One图像分析软件测定目的条带的累积光密度（integrated optical density，IOD），以目的条带的IOD与β-actin条带的IOD的比值作为该目的蛋白的相对表达量。

2.3 统计分析方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据采用“x±s”表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett's T3检验。P<0.05表示有统计学意义。3 结果

3.1 各组增生内膜中Col-Ⅰ、FN表达的比较

与假手术组比较，模型组增生内膜Col-Ⅰ表达显著增强（P<0.01）。与模型组比较，阿托伐他汀组增生内膜Col-Ⅰ表达强度显著降低（P<0.01）；单用当归组、芪归1∶1组和芪归5∶1组增生内膜Col-Ⅰ表达强度也显著低于模型组（P<0.05）；单用黄芪组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。各药物组之间增生内膜Col-Ⅰ表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1。

与假手术组比较，模型组增生内膜FN表达显著增强（P<0.01）。与模型组比较，阿托伐他汀组、单用当归组增生内膜FN表达强度显著降低（P<0.01）；芪归1∶1组也较模型组FN表达强度降低（P<0.05）；单用黄芪组、芪归5∶1组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。各药物组之间增生内膜FN表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图2。

3.2 各组MMP-9、TIMP-1蛋白表达的比较

与假手术组比较，模型组MMP-9蛋白表达显著增强（P<0.01）。与模型组比较，单用黄芪组MMP-9蛋白表达强度低于模型组（P<0.05）；阿托伐他汀组、单用当归组、单用黄芪组、芪归1∶1组和芪归5∶1组MMP-9蛋白表达强度显著低于模型组（P<0.01）。各药物组之间MMP-9蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。

与假手术组比较，模型组TIMP-1蛋白表达强度无显著差异（P>0.05）。与模型组比较，阿托伐他汀组、单用当归组、单用黄芪组、芪归1∶1组和芪归5∶1组TIMP-1蛋白表达强度无明显差异（P>0.05）。各药物组之间TIMP-1蛋白表达强度无显著差异（P>0.05）。见表2、图3。

4 讨论

ECM是分布在细胞表面或细胞之间的大分子， 主要由多糖、蛋白质或蛋白聚糖等组成。ECM在维持血管壁的完整性和血管壁细胞的正常功能中扮演着重要的角色。在动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等病变中ECM与VSMC的相互作用是其重要的病理因素。血管内膜增生性疾病中，血管中膜的VSMC增殖并迁移至内膜后合成大量ECM并在血管壁沉积，从而进一步促进内膜的增生。层黏连蛋白、弹性蛋白、胶原和纤维连接蛋白等是ECM的主要组成成分，其中胶原占据大部分，以Ⅰ型和Ⅲ胶原为主[8]。Nikkari等[9]研究表明，血管内皮损伤第3天起增加最明显的是Ⅰ型胶原，2周达高峰后便逐渐下降。在增生的血管内膜中，可见ECM大量沉积，主要成分是纤维联接蛋白和胶原，占据了89%，仅有11%为细胞成分，ECM的沉积促进了VSMC的增殖与向内膜的迁移[10]。

另外在ECM的合成与降解过程中基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMPs）起着另一关键的作用。目前发现的MMPs有20种之多，其中对胶原的合成与降解起着关键作用的为MMP-2与MMP-9等。在正常情况下组织基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitormatrix metallo proteinase，TIMPs）对MMPs的代谢起抑制作用，目前已发现四种TIMPs对MMPs有着显著的抑制作用，即为：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMPs抑制MMPs的机制是其与MMPs以1∶1的比例非共价结合。在介入术后血管内皮损伤，TIMPs的合成与表达可以抑制血管内膜增生，其机制是可抑制VSMC的增殖与迁移，并能诱导VSMC凋亡[11]。Southgate等[12]研究发现：在行猪冠状动脉剥脱术后，MMP-2、MMP-9在术后第3天的表达明显增强，并且其表达强度能维持21 d不衰减。有研究发现[13]MMPs抑制剂能有效抑制新生的血管内膜形成，在球囊血管损伤造模后即开始给予MMPs抑制剂，可见术后1周内ECM成分中胶原的合成明显减少33%。因此，在血管增殖性病变的防治中，抑制ECM的过度沉积，对于其防治具有重要的治疗学意义。Wu等[14]研究发现，在血管损伤模型大鼠，三七总皂苷能显著降低增生内膜中纤维联接蛋白（FN）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，从而抑制ECM在内膜中的沉积并降解ECM相关蛋白，达到抑制血管内膜增生的作用。有研究发现[7]：补阳还五汤能抑制纤维联接蛋白（FN）、胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）的表达，降解ECM相关蛋白表达，抑制ECM在血管壁的沉积。张伟等[15]研究发现：补阳还五汤中生物碱和苷能显著抑制ECM的沉积，其作用机制是通过抑制Col-Ⅰ及 FN的表达而实现。因此，抑制ECM在血管内膜中的沉积是防治血管增殖性病变的重要靶点。中医药具有多环节多靶点的调节作用，可能通过调节ECM代谢而发挥其抗血管内膜增生的作用。

本研究表明，球囊导管损伤血管内膜后，可造成明显的血管内膜增生。增生内膜中细胞外基质成分Col-Ⅰ、FN表达增强，说明在增生血管内膜中ECM合成增加，进一步促进了VSMC增殖和内膜的增生。阿托伐他汀、单用当归、芪归1∶1配伍可抑制增生内膜中Col-Ⅰ、FN的表达。提示当归及黄芪-当归配伍可抑制ECM在增生内膜中的沉积，从而减轻血管内膜增生的程度。研究还发现，单用黄芪对Col-Ⅰ、FN表达无明显抑制作用，芪归5∶1组能抑制Col-Ⅰ的表达，但对FN表达无明显抑制作用。表明单用黄芪对血管内膜中ECM沉积无显著影响，芪归5∶1配伍抑制ECM沉积的作用弱于1∶1配伍。

一般认为，MMP-9表达增强可促进ECM的降解，TIMP表达增强可抑制ECM的降解。本研究发现在球囊损伤模型，血管MMP-9表达增强，而TIMP-1则无明显变化。这与血管损伤时，通过诱导MMP-9基因表达及促进炎性细胞分泌MMP-9有关，使得MMP与TIMP之间的平衡被破坏[16]。MMP-9的大量表达虽然可以促进ECM的降解，但其同时催化降解VSMC周围的基底膜，使之与周围的基质接触，促使VSMC表型转变为具有迁移和增生能力的分泌型VSMC，并且ECM的降解使得中膜VSMC得以摆脱ECM的束缚，加速了VSMC的迁移，从而促进血管内膜增生[17]。另外MMP-9的大量表达可促进脂蛋白向内膜下沉积及炎性细胞的浸润，可导致斑块形成，加速内膜增生[18]。所以抑制MMP-9的表达可起到稳定斑块、抑制VSMC增殖与迁移的作用。本研究发现阿托伐他汀、黄芪、当归、芪归1∶1及芪归5∶1配伍对MMP-9的表达有明显的抑制作用，表明其能通过抑制MMP-9的表达而达到纠正ECM清除机制失衡、抑制VSMC增殖与迁移及稳定斑块的作用。研究还发现，单用黄芪对MMP-9的表达抑制作用较弱，说明黄芪并非抑制MMP-9表达的主要药物，但黄芪和当归配伍可增强其抑制MMP-9表达的作用。

总之，单用当归、芪归1∶1配伍可抑制增生内膜中ECM沉积，从而抑制VSMC迁移增殖。在黄芪-当归配伍中，当归为其主要的效应药物，黄芪-当归1∶1配伍的作用强于5∶1。

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（本文编辑 杨 瑛）