黑果枸杞无菌苗愈伤组织诱导体系的建立

李琳　杜倩　梁素钰

摘要：  以黑果枸杞为主要研究对象，利用组织培养技术，研究不同浓度的植物生长激素对黑果枸杞愈伤组织形成的影响，及不同外植体器官对愈伤组织诱导分化的影响，同时对其野生资源保护和利用提供技术支持。研究结果表明：最佳愈伤组织诱导培养基为MS + 2，4D 0.4 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L;黑果枸杞根、茎、叶诱导愈伤组织率均高于98%，但茎和叶的诱导时间较短为15天。

关键词：  黑果枸杞;  愈伤组织诱导;  外植体

中图分类号：   S 567. 9， S 603. 6                  文献标识码：   A

黑果枸杞（Lycium ruthenicum） 为茄科 （Solanceae） 枸杞属 （Lycium）多年生灌木，富含花青素、类胡萝卜素、维生素等多种营养成分，还含有丰富的Fe、Zn、Se等微量元素[ 1 - 5 ]。近年来，黑果枸杞药用价值及营养保健作用被广泛传播，市场需求量激增，野生黑果枸杞的价格飞速上涨，巨大的经济利益使得销售者不顾生态环境延续性，开展了毁灭性采摘，从而导致野生黑果枸杞资源破坏严重[ 6 - 7 ]。目前对黑果枸杞的医药研究主要集中在化学活性成分及活性成分提取方面[ 8 - 14 ]。因此，本研究选用种子萌发20天的黑果枸杞无菌苗子叶为外植体，探究不同植物生长激素对愈伤组织诱导的影响，然后选取最优配比对黑果枸杞子叶、下胚轴、胚根等不同外植体器官进行愈伤组织诱导研究，建立黑果枸杞愈伤组织诱导体系，为今后进一步优化黑果枸杞无菌苗组培快繁体系奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

本研究选用的黑果枸杞种子购买于青海省宁夏市。

1. 2 方法

1. 2. 1 种子的消毒

将黑果枸杞种子浸于蒸馏水中，于4℃冷藏过夜后，弃去浮于上方的干瘪种子，并将其反复冲洗多次，去除果肉等杂质，以免消毒不彻底导致种子萌发过程中真菌感染。将冲洗后的种子用75%酒精和NaClO进行消毒，消毒时间分别为30 s和5～10 min，换用消毒剂时用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌水冲洗3～5次，待用。

1. 2. 2 黑果枸杞无菌苗的种植

将消毒后的黑果枸杞种子播种于1/2MS培养基上，在组织培养室中进行培养。培养条件为：温度25℃，光照时间12 h/天，光照强度2 000～2 500 lux。

1. 2. 3 愈伤组织诱导培养基的选择

以黑果枸杞无菌苗子叶为外植体，用剪刀将叶片剪成0.5 cm的小块，叶片的正面朝上接种到以MS基本培养基，在培养基上添加不同浓度2，4-D（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）和6-BA（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）诱导愈伤组织（表1），每个培养瓶接种5块外植体，每6个培养瓶为一个处理，每处理重复3次。20天后统计形成愈伤组织的百分率，进行愈伤组织诱导培养基的筛选。

1. 2. 4 不同外植体类型对愈伤组织诱导和分化的影响

为找到最适合黑果枸杞组织培养的外植体，本研究将萌发10天无菌苗的子叶、下胚轴、根作为外植体接种到筛选出的最优愈伤组织诱导培养基中，3周后统计愈伤组织数，选择出最适黑果枸杞组织培养外植体。

2 结果与分析

2. 1 愈伤组织诱导培养基的选择

愈伤组织在添加10种不同激素配比的诱导培养基上（3次重复）培养3周后，均诱导出愈伤组织（表2），YD4、YD5、YD6的诱导率高于98%，YD7、YD9、YD10上的诱导率90%以上，YD8诱导率83%左右，YD3诱导率71.11%，而YD1、YD2诱导率低于10%，显著低于其他梯度。YD6的愈伤组织增殖最快，但愈伤组织呈现为水浸状;YD4、YD5培养基中诱导出的愈伤组织增殖较快，形成淡黄色质地疏松的愈伤组织团;YD1、YD2、YD7虽然诱导出愈伤组织，但为深绿色颗粒状紧密愈伤组织团;YD7愈伤组织褐化;YD3、YD8、YD9的愈伤组织上诱导的愈伤，颜色为淡黄色、质地紧密呈颗粒状，YD9愈伤组织少许褐化。

单独使用6-BA，低浓度下对诱导愈伤作用较小，而高浓度下能够诱导愈伤，但愈伤组织长势不好，发生褐化;单独使用2，4-D能诱导出愈伤组织，但是愈伤组织呈水浸状，高浓度下发生褐化。说明了黑果枸杞诱导愈伤组织对2，4-D敏感，2，4-D浓度0.4 mg·L-1配合低浓度6-BA诱导愈伤组织效果最好。

2. 2 不同外植体器官对愈伤组织诱导和分化的影响

将黑果枸杞萌发10天的无菌种子苗的子叶、下胚轴、胚根作为外植体，分别接种到2.1中确定的最适愈伤诱导培养基MS + 0.4 mg/ml 2，4D + 0.2 mg/ml 6-BA中，3周后统计愈伤组织数（表3）可知：黑果枸杞种苗下胚轴、子叶、胚根都表现了极高的愈伤组织诱导率，其中胚根诱导出愈伤组织的时间最短为10天，子叶及下胚轴均为15天，但是胚根诱导形成的愈伤组织经过多次继代，愈伤组织逐渐褐化，几乎无法分化出丛生芽，而子叶和下胚轴诱导形成的愈伤组织能够正常诱导分化出丛生芽，但是由于下胚轴诱导出的愈伤组织体积较小，在规模化培养中产量低于子叶诱导的愈伤组织，因此工厂化组培快繁体系应选用子叶为外植体为最佳。

3 结论与讨论

3. 1 乔永旭[ 15 ]以子叶、下胚轴、胚根3种器官为外植体诱导愈伤组织研究表明：黑果枸杞下胚轴诱导率最高，与本研究不一致，该现象可能是由于选取的植物生长素不同，及生长素与分裂素比例差异造成的。植物组织培养过程中常用的生长素有2，4D，NAA、IAA等，生长素具有促进细胞延长、诱导愈伤组织形成等作用，而常见的细胞分裂素6-BA、KT等能够促进植物细胞的分裂與膨大。当植物生长素与细胞分裂素的比值低时，有利于丛生芽诱导，当比值高时，有利于生根诱导。

3. 2 高浓度的细胞分裂素会导致玻璃化苗的出现，尤其是6-BA浓度与玻璃化苗的发生呈显著正相关，因此在植物组织培养中6-BA的浓度不易过高。本研究结果表明：适于黑果枸杞愈伤组织诱导培养基的6-BA浓度在0.4 mg/L为宜。褐化是植物组织培养中常出现的显现，褐化产物对植物组织细胞中的许多酶产生抑制作用，从而导致植物材料逐渐死亡。研究表明：多种植物组织培养外植体的选择、培养条件等因素有关。外植体的选择以幼芽为佳，老龄外植体和根尖均有一定程度的褐化现象。此外，培养过程中温度过高、光照时间过长、光照强度过大也是造成褐化的主要原因。

3. 3 本研究中组织培养基最佳愈伤组织诱导培养基为MS + 2，4D 0.4 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L;黑果枸杞下胚轴、子叶、胚根诱导愈伤组织率均高于98%，但茎和叶的诱导时间较短为15天。

参考文献

[1] 蔺定运，  李炜，  甘青梅，  等.  黑果枸杞果實色素的初步研究[J].  中国食品添加剂，  1995（2）：  5 - 9.

[2] 陈亮，  张炜，  陈元涛，  等.  响应曲面法优化黑果枸杞多糖的超声提取工艺[J].  食品科技，  2015，  40（1）：  220 - 227.

[3] 任小娜，  陈志梅，  曾俊，  等.  黑果枸杞中原花青素提取条件的优化与含量测定[J].  食品与发酵工业，  2015，  41（1）：  147 - 150.

[4] 韩爱芝，  白红进，  耿会玲，  等.  响应面法优化超声辅助提取黑果枸杞叶片总黄酮的工艺研究[J].  西北林学院学报， 2013，  28（1）：  114 - 118， 122.

[5] 马继雄.  道地药材黑果枸杞的应用研究进展及青海的发展前景[J].  青海师范大学学报：  自然科学版，  2012， 28（3）：  53 -56，  85.

[6] 甘青梅，  骆桂法，  李普衍， 等.  藏药黑果枸杞开发利用的研究[J].  青海科技，  1997（1）：  17 - 19.

[7] 冯建森，  刘志虎.  酒泉市野生黑果枸杞资源及利用[J].  林业实用技术，  2013（2）：  62 - 64.

[8] 浩仁塔本，  赵颖，  郭永盛，  等.  黑果枸杞的组织培养[J].  植物生理学通讯，  2005（41）5：  631.

[9] 马彦军，  程艳青，  张荣梅.  黑果枸杞组织培养快繁技术研究[J].  林业科技通讯，  2015（5）：  26 - 28.

[10] 杨宁，  李宜珅，  陈霞，  等.  黑果枸杞的组织培养和快速繁殖[J].  西北师范大学学报（自然科学版），  2：  84 - 88.

[11] 孙晓红，  位书磊，  宋强，  等.  黑果枸杞的叶片分化与快速繁殖[J].  植物生理学报，  2015（5）：  653 - 658.

[12] 李冬杰.  植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导、 增殖及分化的影响[J].  河北林业科技，  2016（4）：  1 - 5.

[13] 冀菲，  唐晓杰，  程广有.  黑果枸杞组培繁殖培养基选择[J].  北华大学学报（自然科学版），  2016，  17（4）：  537 - 538.

[14] 王祎，  赵彤彤，  杨魏，  等.  红松成熟合子胚愈伤组织诱导的适宜培养条件[J].  森林工程，  2015，  31（2）：  5 - 7.

[15] 乔永旭.  黑果枸杞高频再生体系的建立[J].  中药材，2015，  38（10）：  2 031 - 2 034.

Establishment of Callus Induction of Non-bacterial Seedling

of Lycium ruthenicum

（The Key Laboratory of Forest and Forestry Ecological Engineering in Heilongjiang Province，  Heilongjiang Forest Engineering and Environment Research Institute，  Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract This study selected Lycium ruthenicum as the main research object， using tissue culture technology， the effects of different concentrations of plant growth hormone and different explants on callus formation were studied， which could provide technical support for its protection and utilization of the wild. The results showed that the optimal callus induction medium was MS + 2，4D 0.4 mg·L-1 + 6-BA 0.2 mg·L-1. The callus rate of root， stem and leaf was more than 98%， but the induction time of stem and leaf was 15 days shorter.

Key words Lycium ruthenicum;  Callus induction;  Explant