湖南省长沙市番茄黄化曲叶病毒的检测与系统发育分析

鲁清华 张宇 张松柏 彭静 郑立敏 张德咏 刘勇

摘要：【目的】对湖南省长沙市发生的疑似番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）样本进行检测，明确TYLCV在湖南长沙的发生情况，为TYLCV的防控提供科学依据。【方法】2016年3和11月，在湖南长沙采集疑似TYLCV样本48份，采用已发表的TYLCV不同株系的全基因组序列，利用DNAMAN进行序列比对，根据保守序列设计特异性引物TY-T-F和TY-T-R、TY-P-F和TY-P-R对番茄样本的DNA进行PCR、Southern印迹杂交（Sourthern blotting）检测和系统发育分析。对呈阳性条带的PCR产物进行切胶回收并送样测序，在NCBI上进行BLAST比对分析，利用系统发育分析TYLCV湖南长沙分离物与国内外株系的相似性。【结果】采集的48份样本中有42份样本能扩增出目的条带，阳性检出率为87.5%；将42个阳性克隆序列导入MEGA 7.0，得到27个分离物。对测序结果进行同源性分析、多重比对、聚类分析及进化分析，结果显示27个湖南长沙TYLCV分离物与我国其他省（市）分离物的相似性在98.5%～99.8%，与伊朗株系（AJ132711和GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分别介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%。【结论】TYLCV已在湖南长沙发生危害，需加强检疫工作，防止从疫区调运感病番茄，以控制病害扩散蔓延。

关键词： 番茄黄化曲叶病毒；番茄；检测；湖南长沙

中图分类号： S436.412.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1332-06

0 引言

【研究意义】番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是一种在全世界暴发的番茄病毒之一。最先在以色列报道发生（Picó et al.，1996），目前已逐步扩展到热带和亚热地区的多个国家（Segbefia et al.，2018），在我国江苏（赵统敏等，2007；姜静等，2018）、山东和安徽（余文贵等，2009）、天津（郝永娟等，2010；金凤媚等，2011）、河北（李志勇等，2011）、四川（熊艳等，2011）、北京（宋晰等，2013）、湖北（汤亚飞等，2015）及河南（王浩权等，2016）等地区均有发生，严重危害我国番茄等经济作物的生产。番茄是湖南省消费量最大、栽培面积最广的蔬菜作物之一，是农民增收致富和出口创汇的重要经济作物，因此，对番茄黄化曲叶病害的检疫及预防工作必须严格把关，以确保湖南省番茄生产的健康良性发展。【前人研究进展】国内外对TYLCV的研究主要集中在基因组结构、传毒介体、地理分布、症状和传播途径等方面。TYLCV属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）成员，为单组分双生病毒，DNA-A组分大小2.7～2.8 kb，可用RNA干扰方法将植株体内的病毒滴度降低（Ammara et al.，2015）。利用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）技术，SlMAPK3可调节水杨酸和茉莉酸的信号传导，从而使番茄对TYLCV的耐受性增强（Li et al.，2017b）。根据生态学和流行病学研究，在自然界中TYLCV经烟粉虱持久性传播（Kil et al.，2016；Li et al.，2017a；Zhao et al.，2018），目前已逐步扩展到热带和亚热带地区的多个国家（Segbefia et al.，2018），并蔓延到印度洋海域和包括澳大利亚、新喀里多尼亚和毛里求斯等的太平洋海域（Mabvakure et al.，2016）。TYLCV侵染番茄的典型症状为上部新叶叶片黄化变小，叶缘卷曲，苗期染病可能导致绝收（Li et al.，2017a）。【本研究切入点】TYLCV是一种在全球范围内广泛传播的病毒，该病毒在我国多地被发现，极易随种苗传播，对番茄产业存在极大威胁。虽然该病毒的传播介体烟粉虱在湖南省为害严重，但目前尚无TYLCV在湖南发生危害的报道。2016年3和11月，湖南长沙市陆续发现疑似TYLCV的番茄植株，本研究团队立即进行大田采样检测，鉴定疑似该病毒的番茄幼苗及成苗，调查发生情况。【拟解决的关键问题】采用TYLCV特异引物TY-T-F和TY-T-R、TY-P-F和TY-P-R对湖南长沙发生的疑似TYLCV番茄样本的DNA进行PCR和Southern印迹杂交（Sourthern blotting）检测，以明确TYLCV在湖南长沙的发生情况，为TYLCV的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样本采集 于2016年3和11月从湖南长沙采集疑似TYLCV样本48份，其中番茄幼苗15份、叶片33份（表1）。样本用自封袋封口，写好标签，带回实验室。

1. 1. 2 主要试剂和仪器设备 10×Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和琼脂糖购自北京全式金生物技术（Transgen Biotech）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒采用美国Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒；荧光染料SYBR系列购自Thermo Fisher生产的SYBR-GREEN系列；PCR仪为基因有限公司（Gene Company Limited）产品；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I购自Roche公司；BioDOC-IT凝膠成像系统为美国伯乐公司产品；阳性对照DNA由湖南省农业科学院植物保护研究所提供，阴性对照为灭菌双蒸水。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 番茄总DNA提取 采用CTAB法提取番茄叶片总DNA（Turaki et al.，2017）。番茄叶片在液氮中研磨成粉末，加入CTAB抽提缓冲液总DNA，经氯仿∶异戊醇（体积比24∶1）纯化，加入异戊醇沉淀DNA，加入ddH2O溶解，于-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 引物设计 根据已发表的TYLCV不同株系全基因组序列，利用DNAMAN进行序列比对，根据保守序列设计特异性引物（TY-T-F：5'-CTCTGG AATGAAGGAACAGGCAT-3'，TY-T-R：5'-CCCACT

ATCTTCCTCTGCAATCCA-3'），由华大基因公司合成，预期条带长800 bp，包含AV1及完整AC2和AC3区，分别编码外壳蛋白（Coat protein，CP）、移动蛋白（Movement protein，MP）及复制增强蛋白（Replication enhance protein，REn）。

1. 2. 3 PCR检测 PCR反应体系50.0 μL：10×Bu-ffer 5.0 μL、dNTP 200 μmol/L，上、下引物各1.0 μL，DNA模板0.1～2.0 μg，Taq DNA聚合酶1.0 μL，加ddH2O至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结果反应。每个样本进行3次重复扩增检测。

1. 2. 4 电泳检测 将PCR扩增产物和番茄总DNA用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，在BioDOC-IT成像仪照像，将有特异条带的扩增产物经凝胶回收试剂盒回收纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所得序列在NCBI中进行BLAST比对分析。

1. 2. 5 Sourthern blotting检测 根据1.2.4的测序结果设计Sourthern blotting特异性引物（TY-P-F：5'-CAGAATGTATCGAAGCCCTGATG-3'，TY-P-R：5'-TGCCTGTTCCTTCATTCCAGAG-3'），以總DNA为模板进行PCR扩增，目的片段长约350 bp，回收后用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I进行地高辛标记，获得探针， -20 ℃保存。以番茄总DNA进行琼脂糖凝胶电泳（0.8%浓度）、转膜，杂交方法参照说明书。以健康番茄总DNA为阴性对照，接种TYLCV番茄总DNA作为阳性对照。

1. 2. 6 TYLCV扩增片段序列分析 测序结果利用DNAMAN v6.0进行序列处理，利用Seqman v7.1进行序列同源性分析，利用MEGA 7.0进行多重比对、聚类分析及进化分析，采用邻近（Neighbor-Joning）法构建系统发育进化树，进化树可信度使用1000次自导复制验证。

2 结果与分析

2. 1 TYLCV在湖南长沙的发生率调查结果

分别以设计的引物对番茄样本基因进行PCR和Southern blotting检测，结果分别扩增出800（图1和图2）和350 bp（图3）的片段，均与预期结果一致。表明湖南省长沙市采集的疑似感病番茄样本均存在TYLCV侵染。

由表2可知，48份番茄样本中有42份样本检测出TYLCV感染，检出率为87.5%，其中2016年3月采集的番茄幼苗样本TYLCV检出率为100.0%；2016年11月采集的番茄叶片样本TYLCV检出率为81.8%。

2. 2 湖南长沙TYLCV分离物序列分析结果

利用DNAMAN v6.0对42个阳性序列进行处理，同时用Seqman v7.1进行序列同源性分析，利用MEGA 7.0进行多重比对、聚类分析及进化分析，结果得到27个分离物，27个TYLCV分离物的相似性在98.6%～100.0%，与我国其他省（市）分离物的相似性在98.5%～99.8%，与伊朗株系（AJ132711、GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分别介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%。

聚类分析结果（图4）显示，TYLCV可分为5个分支，TYLCV湖南长沙分离物与我国辽宁（KJ754193，KJ754194）、上海（GU434143和GU434144）和广东（JQ867092）等省（市）的TYLCV分离物及澳大利亚（GU178814）、墨西哥（FJ012358）等TYLCV分离物聚类在同一分支。

3 讨论

目前，TYLCV已在我国20多个省（市）发生并危害番茄生产，该病毒的传播介体烟粉虱在湖南省为害严重，但尚未见在湖南省发生危害的报道。本研究对湖南长沙疑似感染TYLCV的番茄样本进行PCR、Sourthern blotting检测和测序分析，结果表明湖南长沙已有TYLCV发生，是TYLCV在湖南长沙的首次报道。

从系统发育进化树（图4）分析可知，湖南长沙27个TYLCV分离物的相似性在98.6%～100.0%，说明这些分离物毒源相同，番茄从同一地方调运，11月采集的番茄样本的毒源有可能来自3月采集的番茄；湖南长沙TYLCV分离物与我国其他省（市）分离物比较，相似性在98.5%～99.8%，从系统发育进化树可知，其分离物与广东（JQ867092）、浙江（AM698117）和天津（GU563330）等株系相似性较高，与上海株系（GU434144）和辽宁株系（KJ754194）相似性最高，说明湖南地区的TYLCV最有可能来自上海或辽宁地区的番茄调运；湖南长沙TYLCV分离物与国外分离物比较，与伊朗株系（AJ132711和GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分别介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%，说明湖南长沙TYLCV也有可能来自进口自澳大利亚或葡萄牙的番茄。因此，湖南长沙TYLCV毒源可能来自澳大利亚和葡萄牙进口的番茄，或来自辽宁和上海等地调运的番茄。

据报道，TYLCV是一种在全世界暴发的番茄病毒之一，最先在以色列报道发生，已在中东地区蔓延（Picó et al.，1996），故而湖南长沙TYLCV分离物与中东地区伊朗株系（AJ132711和GU076453）具有90.7%～91.5%的相似性。目前TYLCV已逐步扩展到热带和亚热带地区的多个国家（Segbefia et al.，2018），在我国江苏（赵统敏等，2007；姜静等，2018）、河南（王浩权等，2016）、山东和安徽（余文贵等，2009）、河北（李志勇等，2011）、北京（宋晰等，2013）、天津（郝永娟等，2010；金凤媚等，2011）、四川（熊艳等，2011）和湖北（汤亚飞等，2015）等20多个地区也先后发生危害，总体趋势是从沿海地区逐渐向内陆乃至全国蔓延，严重危害我国的番茄生产。

目前，国内外尚缺乏对TYLCV抗性较好的番茄品种。Mangal等（2017）分析对比辣椒和番茄的基因组，找到番茄抗性区域，杂交选育TYLCV抗性品种。Segbefia等（2018）通过对具有TYLCV抗性的野生番茄与栽培番茄回交杂交，选育出具有一定抗性的番茄品种。因此，在番茄生产上，选择抗TYLCV品种非常重要。此外，在番茄苗期应注意检测和防治TYLCV发生危害，以防TYLCV在湖南省快速扩展蔓延。

4 结论

对48份番茄样本的PCR和Sourthern blotting检测结果表明，TYLCV在湖南长沙已有发生。今后需加强检疫工作，防止从疫区调运感病番茄，以控制番茄黄化曲叶病毒病进一步扩散蔓延。

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（責任编辑 麻小燕）