南方红壤坡地人工林生态系统土壤细菌群落结构与丰度季节变化特征

许越 杨杰 陈闻 侯海军 李卫华 陈春兰 秦红灵

摘要：【目的】探讨南方红壤坡地人工林生态系统土壤细菌群落结构与丰度的季节变化特征，为我国南方酸性红壤丘陵区生态修复造林树种的选择提供理论依据和参考。【方法】以湿地松林和油茶林土壤为研究对象，在两年的时间里分季节采集土壤样品，利用荧光定量PCR（qPCR）分析土壤细菌的丰度，末端限制性酶切片段长度多态性（T-RFLP）分析土壤细菌的群落结构。【结果】油茶林的土壤水含量、铵态氮和可溶性有机碳（DOC）含量及土壤细菌丰度均显著高于湿地松林土壤（P<0.05，下同），且两种林地的土壤细菌群落结构也产生明显分异。土壤细菌丰度和土壤理化性状随季节变化产生波动，但年际间变化规律不一致。两种林地土壤四季共有物种占绝对优势，群落结构季节变化不明显。土壤硝态氮、铵态氮和DOC含量与土壤细菌群落结构呈极显著相关（P<0.01）。除油茶林的土壤细菌丰度与土壤水含量呈显著正相关外，其他环境因子与细菌丰度间的相关性不显著（P>0.05）。【结论】树种不同而诱导的土壤养分状况变化是调控土壤细菌群落结构的关键因子。在我国南方红壤丘陵区，油茶林是一种比湿地松林更有利于提升土壤肥力和维持林地土壤生态质量的造林树种。

关键词： 南方红壤；人工林；季节变化；细菌丰度；群落结构

中图分类号： S154.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1289-08

0 引言

【研究意义】油茶（Camellia oleifera Abel.）是我国南方红壤丘陵区主要的经济树种，因茶油经济效益高，油茶种植面积逐年增加（罗汉东等，2016）。湿地松（Pinus elliottii Engelin）适应性强、抗旱耐脊薄，造林成活率高，是我国南方重要的造林树种之一（唐代生等，1998）。不同树种因根系分泌物和养分吸收规律等存在差异，可能对土壤环境质量造成不同影响。土壤微生物对土壤环境变化高度敏感，是评价土壤环境质量的有效生物学指标。因此，对比研究油茶林和湿地松林土壤微生物群落及其生态功能，可从微生物分子机理揭示不同树种影响南方红壤环境质量的内在机制。【前人研究进展】林地类型不同或同类型林地发育阶段不同，均会导致土壤微生物群落结构差异。刘丽等（2009）研究了不同发育阶段杉木人工林的土壤微生物群落结构，发现随杉木发育年龄的增长，土壤微生物群落多样性和丰度显著增加。汪其同等（2015）对比分析杨树人工林根际和非根际土壤细菌群落差异，发现根系对根际微生物的选择是导致根际微生物群落组成和结构产生显著差异的重要机制。王巍巍等（2015）采用磷脂脂肪酸法研究凋落物管理对樟子松人工林土壤微生物群落结构的影响，发现凋落物加倍引起的土壤有机碳和养分增多是微生物量升高的主要原因。邓娇娇等（2017）对比研究辽西半干旱区油松—蒙古栎混交林与人工纯林的差异，发现混交林土壤微生物功能多样性显著高于人工纯林，更有利于树木的生长发育；而地下根际效应及地上凋落物不同是造成不同林地土壤微生物结构差异的主要原因。殷萌清等（2017）对比研究红树植物人工修复区与天然区土壤微生物结构差异，发现人工林土壤微生物多样性和丰度均显著低于天然林。另一方面，季节变化引起的土壤温度、湿度和养分含量变化也是驱动土壤微生物变化的重要因子。Myers等（2001）研究发现，土壤温湿度、降雨量、土壤理化性质和树种特性等因素是某一特定林地生态系统土壤微生物量季节变化的主要调控因子。王国兵等（2008）研究发现，受多种生态因子综合作用的影响，林地生态系统中土壤微生物具有明显的季节性波动。Patel等（2010）研究发现，即使处于同一气候区域，不同生态系统对季节变化的响应也不同。【本研究切入点】目前，针对南方红壤区重要人工林地同一气候条件下不同林地类型在不同季节土壤微生物变化特征的研究还较匮乏。【拟解决的关键问题】选择湿地松和油茶林两种人工林地利用方式，在两年时间内分不同季节采集土壤样品，利用荧光定量PCR（qPCR）和末端限制性酶切片段长度多态性（T-RFLP）分析土壤细菌的群落结构对人工林树种和季节变化的响应，评价油茶林和湿地松林对土壤环境质量的影响，以期为我国南方酸性红壤丘陵区生态修复造林树种的选择提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1. 1 研究区概况

本研究在中国科学院桃源农业生态试验站进行，试验站位于湖南省桃源县漳江镇宝洞峪村（东经111°26′，北纬28°55′），年均气温16.5 ℃，年降水量1440 mm，日照时数1520 h，土壤类型为第四纪红土发育的红壤。

1. 2 试验方法

中国科学院桃源农业生态试验站坡地不同利用方式长期定位观测试验于1995年開始，在场内选择一处坡面（坡长62 m，坡度8°～11°，投影面积1 ha）作为坡地不同利用方式长期定位观测试验区。试验区内每种土地利用方式投影面积20 m×50 m。试验前（1995年）土壤基本理化性状为：pH 4.45，有机质28.9 g/kg，全氮1.93 g/kg，全磷0.66 g/kg，全钾1.39 g/kg（秦红灵等，2011）。

土壤样品采自坡地不同利用方式长期定位观测试验场湿地松林和油茶林，两种人工林试验区内分别设位于相同坡位的3个小区（50 m×5 m）作为重复样地。1995年湿地松和油茶种植后保持无任何人工扰动，到2012年两种林地的土壤基本理化性质已发生改变（表1）。

1. 3 土壤样品采集及理化性状测定

土壤样品采集于2012年10月20日，2013年1月17日、4月12日、7月9日和10月22日，2014年1月19日、4月3日，7月19日。1、4、7和10月分别代表冬天、春天、夏天和秋天，不同年际样品作为采样重复。每小区S形多点采集0～20 cm土壤样品，共采集48个土壤样品（2树种×4采样季节×2采样年×3重复样地）。土壤样品使用灭菌工具采集，防止除土壤样品外的其他物品与土样接触，防止杂菌污染及土壤样品间的交叉污染，样品采集时去除林地表层凋落物及明显的石块和植物根系。采集完后混匀，一部分土样（100 g）用液氮冷冻后于-80 ℃保存，用于分子生物学研究，另一部分土样（400 g）用于常规分析。

采样当天利用地温计测定5 cm土层土壤温度。利用烘干法测定土壤水含量。用1.0 mol/L KCl溶液浸出土壤悬浮液，过滤后用流动注射系统（FIAstar 5000，Foss Corporation，Hillerod，Denmark）分析土壤氨态氮和硝态氮含量；用0.5 mol/L K2SO4浸提土样，过滤后用全氮仪（TOC-VMP，Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）测定土壤可溶性有机碳（DOC）含量。

1. 4 分子生物学分析

1. 4. 1 DNA提取 DNA提取参照杨建和洪葵（2006）的SDS-GITCPEG方法，用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA片段大小，并用NanoDrop核酸蛋白仪（ND-1000）测定DNA浓度及质量。

1. 4. 2 qPCR检测分析 采用16S通用引物1369F/1492R在荧光定量实时PCR仪（ABI 7900，Foster City，CA，USA）上进行定量扩增细菌16S rRNA，引物信息见表2。qPCR反应体系10.0 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM 5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 μg/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环；72 ℃终延伸10 min。标准曲线建立参照Chen等（2012）的方法，标准曲线R2=0.992，扩增效率90%。每个样品3次平行。为消除不同批次扩增的机械误差，将每个基因的样品放置在同一块384孔板上进行。

1. 4. 3 T-RFLP分析 采用16S通用引物27F/1492R扩增细菌16S rRNA，其中上游引物5'端用6-羧基二乙酸荧光素（FAM）标记，用于T-RFLP分析（表2）。反应体系25.0 μL：Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，12.5 mmol/L MgCl2 5.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L正向和反向引物各2.0 μL，模板100 ng，Taq DNA聚合酶1 U，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性35 s； 95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，进行5个循环；95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，进行5个循环； 95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，进行35个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。末端荧光标记的产物用MspⅠ进行消化，其中酶20 U，10×Buffer 5 μL，DNA 500 ng，37 ℃下消化2 h，然后升温至65 ℃将酶灭活10 min。酶切产物的T-RFLP分析由上海桑尼生物技术有限公司完成。T-RFLP图谱中限制性片段（T-RF）范围在50～550 bp，在平行试验图谱中重复再现的峰纳入统计分析，并去除OTU丰度<1%的T-RFs。T-RFLP图谱中每个限制性片段（T-RF）为一个OTU，T-RFs片段大小±1 bp被认为是同一个OTU。

1. 5 统计分析

统计分析前细菌丰度数据通过lg转化为正态分布，使用SPSS 10.0进行数据的统计描述、双因素方差分析（Two-way ANOVA）和Pearson相关分析，并利用Canoco v.4.5冗余分析土壤理化性质对土壤细菌群落结构的影响，蒙特卡洛检验显著性。

2 结果与分析

2. 1 人工林生态系统土壤理化性状的季节变化动态

双因素方差分析结果（表3）表明，油茶林和湿地松林土壤硝态氮、铵态氮和DOC含量存在显著差异（P<0.05，下同），土壤温度、土壤硝态氮和DOC含量受季节变化的影响显著。受季节大气温度变化的影响，湿地松林和油茶林的土壤温度呈明显的季节变化规律，但两种林地的土壤温度无明显差异，夏季最高温在25 ℃左右，冬季最低温在7 ℃左右（图1-A）。两种林地的土壤水含量走势趋于一致，采样第一年秋季水含量最高，采样第二年夏季最高，季节变化规律不明显，且年际间变化趋势不一致（图1-B）。土壤硝态氮含量湿地松林高于油茶林（图1-C），土壤铵态氮和DOC含量则相反（图1-D和图1-E）。进一步的相关性分析发现，湿地松林硝态氮含量与土壤温度（r=0.51）和土壤水含量（r=0.64）呈极显著正相关（P<0.01，下同）。

土壤基本理化性质也受到树种的影响，油茶林土壤有机质和全氮含量均高于湿地松林，但土壤有效钾和全钾含量湿地松林高于油茶林（表1）。

2. 2 人工林生态系统土壤细菌群落结构的季节变化动态

根据酶切獲得的16S rRNA片段T-RFLP图谱（图2-A）可知，湿地松林和油茶林细菌群落组成存在明显差异，但各林地土壤细菌群落季节变化均不明显。湿地松林土壤中大于10.00%相对丰度的优势16S rRNA片段是90和148 bp，有2个优势种群，相对丰度分别为23.06%和12.64%；油茶林土壤中优势16S rRNA片段是90、148和180 bp，有3个优势种群，相对丰度分别为31.08%和12.68%和11.02%。某些相对丰度较少的16S rRNA片段在两种林地系统间也产生明显差异，如192、214、216、266、280、434和468 bp只在湿地松林土壤出现，而130、146、156、228、262、286、428、430、474和476 bp只在油茶林土壤出现。

冗余分析（RDA）结果（图2-B）表明，前两个主成分分别解释变量的85.4%和10.0%，湿地松林和油茶林土壤细菌群落分别聚类于图的左右两侧，在第一主成分上明显分异；不同季节土壤细菌群落聚类不明显。维恩分析（图3）发现，湿地松林和油茶林四季共有物种占绝对优势。湿地松林第一个采样年（S1）四季共有物种18种，占总物种数的58.1%，占物种丰度的92.7%；第二个采样年（S2）四季共有物种22种，占总物种数的71.0%，占物种丰度的97.5%；油茶林第一个采样年（Y1）四季共有物种18种，占总物种数的58.1%，占物种丰度的91.5%；第二个采样年（Y2）四季共有物种19种，占总物种数的54.3%，占物种丰度的93.4%。

2. 3 人工林生态系统土壤细菌丰度的季节变化动态

双因素方差分析结果（表3）表明，油茶林和湿地松林土壤细菌丰度差异显著，但季节变化不明显。由图4可看出，除第一年春季外，其他季节油茶林的土壤细菌丰度均高于湿地松林；两种林地的土壤细菌丰度随季节变化产生波动，但年际间季节变化趋势不一致，第一年秋季和冬季明显高于春季和夏季；第二年呈秋、冬、春和夏逐步增加的趋势。

2. 4 人工林生态系统土壤细菌组成季节变化与土壤因子的关系

蒙特卡洛检验结果（表4）显示，土壤硝态氮、铵态氮和DOC含量与土壤细菌群落结构极显著相关，是影响土壤細菌群落结构的关键环境因子，分别解释群落结构变化的27.42%、19.91%和12.58%。对湿地松林和油茶林土壤细菌丰度与土壤环境因子进行相关性分析发现，除油茶林土壤细菌丰度与土壤水含量呈显著正相关外，其他环境因子与细菌丰度间的相关性不显著（P>0.05）。

3 讨论

尽管研究区域、管理方式和气候条件均相同，不同树种对林地生态系统土壤养分状况及土壤微生物产生的影响也存在差异。Kelty（2006）在研究落叶林、针叶林和针阔混交林3种林地类型土壤养分状况时发现，针叶林的土壤生产力显著低于落叶林和针阔混交林。郑华等（2006）在我国南方红壤区对不同林地类型的土壤生物学特性进行研究，发现油茶林具有更高的林下植被生物和根系生物量，导致土壤有机质含量高于湿地松林，细菌数量则显著高于湿地松林。本研究分析了油茶林和湿地松林的土壤理化性状，发现两种林地土壤表层有机质、全氮、铵态氮和DOC含量均表现为油茶林高于湿地松林，且与土壤养分状况一致，油茶林土壤细菌丰度也显著高于湿地松林。胡承彪等（1990）研究表明，林地生态系统中林型、植被、林分组成和土壤有机质含量等生态因素是影响土壤微生物数量的关键因素。湿地松属于针叶林，针叶中含有大量细菌难以分解利用的物质（单宁、树脂、纤维素和木质素等），土壤细菌因得不到充足的养分而无法进行大量繁殖；油茶林属于阔叶林，落叶残体含有大量容易被细菌分解利用的物质（氮素和水分等），充足的养分条件有利于大量细菌繁殖（杨尚东等，2014）。同时，油茶林较高的凋落物和根系分泌物进入土壤，为土壤细菌的生长提供了更多的营养物质来源，进而增加了土壤细菌的数量（Haichar et al.，2014）。

除土壤细菌数量外，土壤细菌群落结构在油茶林和湿地松林间也产生明显分异。土壤地下微生物群体的数量和种类随地上植物种类的变化而发生变化，不同植物种类其归还土壤物质的数量和类型不同，造成土壤细菌群落结构的不同（Zhong and Makeschin，2006）。本研究发现土壤有效态养分含量（土壤硝态氮、铵态氮和DOC含量）与土壤细菌群落结构密切相关，且在两种人工林间存在显著区别。因此推测由于树种不同而诱导的土壤养分状况变化是调控土壤细菌群落结构的关键因子。方昉等（2007）的研究也表明，土壤微生物数量与土壤酶活性总体呈正相关，而土壤酶主要来源于土壤微生物的代谢过程。由此可知，我国南方酸性红壤坡地油茶林对土壤物质的转化能力优于湿地松林。

季节变化对土壤细菌群落结构和丰度的影响明显小于林地树种不同造成的影响。尽管已有许多研究表明土壤微生物群落结构和丰度等受季节变化的显著影响，但研究结果并未得到相对统一的规律（Edwards and Jefferies，2013）。本研究发现土壤细菌数量较高的季节基本出现在夏秋季，可能是因为夏秋季适宜的土壤温度、充足的水分状况为土壤微生物的生长提供了合适的土壤环境（Yang et al.，2010）；而两种林地的土壤细菌丰度在4～5月达低谷，可能是由于此时未到雨季，导致土壤细菌活性降低，非优势种群减少（Davidson et al.，2000）。此外，树木生长发育与土壤微生物对养分的利用间存在的竞争和互相促进关系，也可能造成土壤微生物对季节变化的响应不一致（Wardle，1992）。

此外，本研究发现油茶林和湿地松林土壤硝态氮含量随季节的变化趋势明显不一致，从两种林地的土壤硝态氮含量来看，湿地松林土壤硝态氮含量与土壤温度和水分含量呈显著正相关，说明湿地松林土壤的硝化作用明显受以上两个因素的影响；油茶林的土壤硝态氮含量相对较稳定，说明油茶林土壤中的硝化强度与反硝化强度相当；而湿地松林的土壤硝态氮与氨态氮含量走势相反，可能是湿地松林的硝化过程起主导作用。土壤的硝化反硝化作用受土壤pH、有机质含量、CO2、温度、氮素、水分含量和剖面深度等因素影响（刘若萱等，2014）。本研究通过16S rRNA片段分析土壤细菌时无法区分氮素转化功能微生物在两种林地生态系统受季节变化和树种的影响，因此下一步有必要利用功能基因，针对氮素转化过程开展相关研究。

4 结论

树种不同而诱导的土壤养分状况变化是调控土壤细菌群落结构的关键因子。油茶林和湿地松林均是我国南方红壤丘陵区用于防止水土流失、改良生态环境的造林先锋树种，但油茶林在改良林地表层土壤养分、维持土壤微生物多样性方面优于湿地松林。因此，在我国南方红壤丘陵区，油茶林是一种比湿地松林更有利于提升土壤肥力和维持林地土壤生态质量的造林树种。

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（責任编辑 王 晖）