α—亚麻酸对干旱胁迫下水稻种子萌发的影响

李东 甄春燕 陈德富 陈喜文

摘 要： α-亚麻酸属ω-3系统的多不饱和脂肪酸，是细胞膜的重要组成部分。在干旱胁迫下，植物通过释放α-亚麻酸重塑细胞膜的流动性，但外源添加α-亚麻酸能否提高植物对干旱的抗性尚未可知。该研究采用PEG6000模拟干旱胁迫，探讨了种子萌发过程中α-亚麻酸对水稻萌发和幼苗生长过程中抗旱性的影响。结果表明：在14%和16% PEG干旱胁迫下，水稻种子推迟萌发，幼苗的生长受到抑制。25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸可缓解干旱对水稻幼根和幼苗生长的抑制，且随着干旱程度的增加，缓解作用增强。16% PEG胁迫下，25 μmol·L-1、250 μmol·L-1的α-亚麻酸分别提高幼苗的根长34.3%和29.1%、苗长67.8%和52.0%、根重43.9%和35.2%、苗重59.1%和43.6%。α-淀粉酶活力测定发现，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸分别提高干旱胁迫下水稻种子α-淀粉酶活力为56.7%～70.7%和36.8%～43.8%。水稻幼根活力測定显示，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸分别提高干旱胁迫下幼根活力为11.4%～28.4%和5.4%～22.2%。此外，还对不同干旱胁迫下水稻种子α-淀粉酶活性和幼根活力的变化进行了讨论，认为α-亚麻酸主要通过提高种子萌发过程中α-淀粉酶的活性来缓解所遭遇的干旱胁迫，而对水稻幼根活力的影响则相对有限。

关键词： 水稻， α-亚麻酸， 干旱胁迫， PEG， 种子萌发， α-淀粉酶

中图分类号： Q945.78 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）08-1025-07

Abstract： As a member of ω-3 polyunsaturated fatty acids， α-linolenic acid （ALA） is a component of plant cell membrane. It was shown that plants release ALA to remodel the mobility of cell membrane under drought stress. However， it is not known whether exogenous ALA can increase the plant tolerance to drought stress. In this research， we studied the impact of additional ALA on the drought tolerance of rice seeds under PEG6000 during the germination and seedling stage. The result showed that under 14% and 16% PEG stresses， the germination of rice seeds was postponed and their seedlings growth were inhibited. After addition of 25 μmol·L-1 or 250 μmol·L-1 of ALA， the inhibiting effect owing to the drought stress was relieved. And the alleviatng effect became stronger as the stress became severer. Under drought stress with 16% PEG， 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 of ALA improved the root length by 34.3% and 29.1%， respectively， while improved the seedling length by 67.8% and 52.0%； the root weight was increased by 43.9% and 35.2%， and the seedling weight was increased by 59.1% and 43.6%， respectively. Analysis of α-amylase activity in rice grains under 14% and 16% PEG stress showed， after addition of 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 ALA， the activity was increased by 56.7%-70.7% and 36.8%-43.8%， respectively. Analysis of root activity showed that after addition of 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 of ALA， the root activity under 14% and 16% PEG stresses were increased by 11.4%-28.4% and 5.4%-22.2%， respectively. The change of α-amylase activity and root activity with different PEG concentrations were also discussed. Therefore， we propose that ALA can relieve the drought tolerance of rice seeds mainly by means of increasing α-amylase activity during seed germination and seedling growth stages， while with a limited effect on root activity of rice radicle.

Key words： rice， α-linolenic acid， drought stress， PEG， seed germination， α-amylase

幾乎所有作物的耕作和园艺植物的培养均始于种子。人类种植的作物大多通过种子一代代地延续繁殖下去。种子萌发是指成熟的种子从吸水膨胀开始，到胚根出现结束的生理过程（Rajjou et al，2012）。种子萌发是植物生命周期中的最重要阶段，决定了植物何时能进入自然或农业生态系统（Weitbrecht et al，2011）。种子成功萌发的最关键因素是合适的环境。这个过程不是干种子独立的生物过程，而是与种子的成熟、脱水和幼苗建成相连续的过程。

生物膜是细胞与外界进行信息交流和物质交换的场所。各种生物和非生物胁迫对细胞的伤害主要起始于细胞膜。膜脂和膜蛋白是细胞膜的重要组成部分，它们的结构、组成及相互作用对细胞抵抗胁迫的能力具有重要的影响（王善广等，2000）。生物膜中约有100种脂质，只要其中的1%～2%组分发生改变，就会导致细胞的存活受到影响（王善广等，2000）。膜结构的动态变化是研究植物抗逆的一个重要方面。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由于只含有单一的不饱和脂肪酸，是研究多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）功能的理想材料（Yazawa et al，2010）。利用酿酒酵母的研究发现，PUFA在逆境胁迫下具有保护功能，能提高细胞应对氧化胁迫、低温、盐碱、酒精和碱性pH等逆境的能力（Yazawa et al，2010）。逆境胁迫下，膜流动性的改变为一些重要的整合膜蛋白（如光合作用相关蛋白）发挥功能提供一个稳定的环境。有证据表明，拟南芥叶绿体中油酸（18∶1）含量的改变可启动应对病原体相关基因的表达（Kachroo et al，2001）。并且，油酸（18∶1）含量对植物防御基因表达（Kachroo et al，2001）和种子中曲霉菌繁殖都有一定影响（Calvo et al，1999）。

α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）是ω-3系统的PUFAs，是细胞膜的重要组成部分。植物在应对生物与非生物胁迫时，可通过释放α-亚麻酸，重塑膜的流动性（Iba，2002）。游离的α-亚麻酸是逆境胁迫下的信号分子，本身也是phyto-oxylipin生物合成的前体（Blée，2002）。过表达ω-3去饱和酶基因的转基因烟草，膜中18∶3不饱和脂肪酸含量升高，对盐和干旱胁迫抗性得以提高（Zhang et al，2005）。本文研究了外源添加α-亚麻酸对模拟干旱胁迫下水稻种子萌发和幼苗生长及相关生理特性的影响，为缓解水稻萌发期的干旱胁迫提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

所用的材料是水稻日本晴（Oryza sativa cv. Nipponbare）当年的种子。种子从天津宝坻试验地收获，经过阳光充分晒干后用于实验。

1.2 干旱胁迫下种子的萌发

本研究参照Michel & Kaufmann（1973）提出的PEG6000对水势的影响，采用不同浓度PEG6000模拟干旱处理。水稻种子用0.1%高锰酸钾消毒5 min后，用蒸馏水清洗5～6次，然后播种于铺有滤纸的培养皿内，每皿播种40粒饱满的种子，分别添加10%、12%、14%、16% （w/v）的PEG6000溶液30 mL，28 ℃、12 h光/12 h暗胁迫下培养。每隔2 d分别向培养皿中补加上述相同的溶液5 mL。以芽长超过2 mm计为发芽，定期统计发芽率。培养到10 d时从每皿中选取最先萌发的20株，测定幼苗的根长、苗长、根重和苗重。

1.3 α-亚麻酸对PEG胁迫下种子萌发的影响

首先取70%α-亚麻酸（商品原液）1 mL用无水乙醇溶解，边加水边搅拌定容至10 mL。然后将α-亚麻酸乳液超声震荡至溶液呈乳白色，使α-亚麻酸与水充分混匀，配制成25 mmol·L-1α-亚麻酸母液。选取40粒饱满种子，培养在含0、1、5、25、250 μmol·L-1α-亚麻酸的14%和16% PEG6000滤纸上萌发，培养胁迫同上。种子的萌发和幼苗生长状况的统计也同上。

1.4 α-淀粉酶活性的测定

使用苏州科铭生物技术有限公司的淀粉酶试剂盒。其测定原理是利用α-淀粉酶可作用于淀粉中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、糊精等还原糖，从而能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕红色物质，颜色的深浅可通过测定反应液吸光度来反映。选取各种胁迫下萌发3 d的种子，去掉种皮、萌发的幼根和幼苗，在研钵中充分研磨后，加入1 mL双蒸水，转移到离心管中。4 500 r·min-1离心10 min，吸取500 μL上清转移至试管中，加蒸馏水定容到10 mL，即为淀粉酶提取液。将试管于70 ℃水浴15 min，失活β-淀粉酶。对照管、测定管分别加入3，5-二硝基水杨酸置于40 ℃恒温水浴中保温10 min，540 nm处读取吸光度，计算ΔA=A（测定管）-A（对照管）。以每克组织每分钟催化产生1 mg还原糖定义为1个酶活力单位。α-淀粉酶活性（U·g-1鲜重）=89.4×（ΔA+0.022）÷W，W为种子鲜重。

1.5 根活力的测定

根据Zhang et al（2015）的方法，利用无色的脂溶性光敏感复合物2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）可被细胞内呼吸作用产生的还原氢还原成红色TTF的反应，来检测根的活力。取α-亚麻酸实验中萌发7 d时的根0.05 g，剪成1 cm左右长度片段，浸泡于0.6% TTC（溶于pH7.4的磷酸缓冲液中），30 ℃染色24 h，取出，倒掉染液，用蒸馏水清洗3次后，用95%乙醇于85 ℃抽提20 min，提取液于485 nm波长下测吸光度。

1.6 数据分析

实验重复3次，每种胁迫播种3皿，每皿中含有种子40粒。生理指标数据均通过3次独立测定而获得。利用SPSS11.0下使用ANOVA-Student-Newman-Keuls检测对数据进行显著性差异水平分析，以95%为置信区间。相同胁迫下不同PEG或ALA处理下各组的显著性差异水平，用a、b、c或星号表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度PEG对水稻种子萌发和幼苗生长的影响

为探索不同PEG6000干旱胁迫对水稻种子萌发的影响，将种子播种在含10%、12%、14%、16%、18%、20% （w/v）PEG6000的滤纸上。结果发现，随着PEG浓度的提高，水稻种子的萌发均被推迟，但到第5天时，各PEG浓度下种子均基本全部萌发（表1）。虽然18%、20%PEG胁迫下，7 d时萌发率可达75%，但由于种子均变成黑色，幼苗生长也几乎停止。因此，选择14%、16% PEG6000作为后续干旱处理的浓度。

为进一步探索不同干旱胁迫对水稻早期幼苗生长的影响，统计了14%、16% PEG浓度下萌发10 d时的幼苗生长状况。表2结果发现，与对照相比，14% PEG浓度下，幼苗的苗长、根重、苗重分别是对照的0.65倍，0.36倍和0.42倍；16% PEG浓度下，则分别是对照的0.41倍，0.28倍和0.29倍。随着干旱程度的增强，干旱对幼苗生长的抑制程度也增强。在14%、16% PEG浓度下，水稻幼苗的根长分别是对照的1.63倍和1.26倍，但冠根数目大幅减少。因此，推测干旱胁迫下，水稻幼苗可通过延长根的长度，吸收尽可能多的水分来抵抗干旱逆境。

2.2 α-亚麻酸对干旱胁迫下种子萌发和幼苗生长的影响

为探索α-亚麻酸对干旱胁迫下种子萌发和幼苗早期生长的影响，将水稻种子分别播种在添加0、1、5、25、250 μmol·L-1α-亚麻酸的14% PEG6000和16% PEG6000培养皿中进行发芽。表3结果显示，α-亚麻酸对水稻种子的萌发势和萌发率均没有明显的提高作用。

根据不同浓度α-亚麻酸对干旱胁迫下幼苗生長的预实验，发现25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸的作用最为显著。为此，详细分析了25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸对干旱胁迫下幼苗生长抑制的缓解作用（图1）。从图1结果发现，14% PEG胁迫下，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸对水稻幼苗的生长都有显著影响。与对照相比，苗长分别提高了23.7%和18.9%，根重分别提高了47.0%和51.0%，苗重分别提高了35.3%和29.7%，但根长仅稍有增长；16% PEG胁迫下，随着干旱程度的增强，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亚麻酸对幼苗生长的促进作用增强。与对照相比，幼苗的根长分别提高了34.3%和29.1%，苗长提高了67.8%和52.0%，根重分别提高了43.9%和35.2%，苗重分别提高了59.1%和43.6%。

2.3 α-亚麻酸对干旱胁迫下对水稻种子发芽过程中α-淀粉酶活性的影响

水稻种子萌发时，α-淀粉酶活性是种子活力的一个重要指标。为探究α-亚麻酸对干旱胁迫下水稻种子的萌发能力的影响，测定了种子萌发早期α-淀粉酶的活性。结果发现，14% PEG胁迫下，当用25 μmol·L-1和250 μmol·L-1α-亚麻酸处理水稻种子时，α-淀粉酶活力分别比对照提高了70.7%和43.8%。16% PEG处理下，当用25 μmol·L-1和250 μmol·L-1α-亚麻酸处理水稻种子时，α-淀粉酶活力分别比对照提高了56.7%和36.8%。同一α-亚麻酸浓度下，16% PEG胁迫下的α-淀粉酶活力均比14% PEG胁迫下的活力要低25%～31%（图2）。

2.4 α-亚麻酸对干旱胁迫下水稻种子发芽过程中根活力的影响

根系是植株吸收水分的主要器官，根活力的高低一定程度上反应其耐旱能力。为探究α-亚麻酸对干旱胁迫下水稻幼苗抗旱能力的影响，测定了14%和16% PEG6000胁迫下外加25 μmol·L-1 和250 μmol·L-1后根活力的变化。从图3结果发现，在14% PEG胁迫下，25 μmol·L-1 和250 μmol·L-1α-亚麻酸使根的活力分别比对照提高了28.4%和22.2%；在16% PEG胁迫下，幼根的活力分别比对照提高了11.4%和5.4%。同一α-亚麻酸浓度下，16% PEG胁迫下的根系活力均比14% PEG胁迫下的根系活力要高5%～42%。

3 讨论

利用外源物质提高植物抵抗逆境胁迫的能力，在植物抗性研究中越来越引起关注。目前报道外源添加茉莉酸甲酯（MeJA） （董桃杏等，2007）、水杨酸（SA） （夏方山等，2014）、一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP） （毛亚斌和魏小红，2010）、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）（张春平等，2010）和甜菜碱（GB）等能提高植物抵抗逆境的能力。这些物质大多是通过降低植物膜脂的过氧化程度，促进脯氨酸和可溶性糖的积累，提高SOD、POD等保护酶活性来缓解渗透胁迫（毛亚斌和魏小红，2010；夏方山等，2014）。α-亚麻酸是植物细胞膜脂的重要成分，外源添加是否提高植物抵抗逆境的能力尚未见报道。

本研究利用14%和16% PEG6000模拟干旱，证实了外源添加α-亚麻酸对水稻种子萌发过程中的干旱胁迫具有一定的缓解作用。α-亚麻酸的浓度以25 μmol·L-1和250 μmol·L-1为宜，但浓度过高和过低并未对植株的生长发育产生明显的副作用，显示α-亚麻酸不太可能作为信号分子而发挥作用。而且，α-亚麻酸对干旱胁迫的缓解主要表现在对幼苗早期生长的缓解上，对种子的萌发率并没有提高。对幼苗早期生长的影响也主要表现在苗长、苗重和根重上，对根长的作用并不显著。似乎干旱胁迫下幼苗通过延长根长来提高对水分吸收的能力是一种本能性的反应。

水稻属淀粉型种子，胚乳中主要的贮藏物质是淀粉。当种子萌发时，淀粉酶发挥作用，将贮藏物质水解为简单的有机物，供给种子萌发和幼苗生长发育所需要。水稻种子中存在多种淀粉酶，萌发初期主要起作用的是α-淀粉酶。因此，α-淀粉酶活性的高低关系到种子萌发和幼苗生长的速度，是种子活力的一个重要指标。本研究中，在各种干旱胁迫下（14% PEG和16% PEG），添加α-亚麻酸均能显著提高α-淀粉酶的活性（36.8%～70.7%）。而且，随着干旱程度的增加，α-淀粉酶活性普遍降低。即种子内α-淀粉酶的活性高低与其所遭遇的干旱程度呈负相关。因此我们认为，α-淀粉酶活性高低能反映干旱胁迫下水稻种子的萌发能力。外源添加α-亚麻酸提高种子萌发过程中α-淀粉酶的活性来缓解所遭遇的干旱胁迫。

根系是植物活跃的吸收器官和代谢器官。活力的大小可作为植物根系吸收水分、养分及逆境生存能力的一个重要指标。根系的代谢越强，活力也越强。因此，根活力的高低一定程度上反应其耐旱能力。本研究中，各种干旱胁迫下（14% PEG和16% PEG），添加α-亚麻酸虽在一定程度提高根的代谢活力（5.4%～28.4%）。但高浓度（16% PEG）胁迫下，α-亚麻酸对干旱胁迫下的根系活力的提高非常有限（5.4%～11.4%）。而且，随着干旱程度的增加，根的代谢活力普遍增加。因此，我们推测干旱胁迫下根系活力的增强也可能是植物对干旱胁迫的一种适应性反应，α-亚麻酸通过提高根系活力来提高植物抗旱性的作用非常有限。

总之，本研究从形态和生理的角度证实，外源添加α-亚麻酸主要通过提高干旱胁迫下萌发水稻种子的α-淀粉酶活性，从而达到缓解干旱胁迫的目的。由于α-亚麻酸是一种细胞膜脂的成分，今后的研究应集中于其对膜脂成分及膜脂过氧化程度的影响上，进一步揭示其缓解干旱胁迫的机制。

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