‘宁杞8号’体细胞胚胎发生体系建立

刘静 袁婷 倪细炉 朱强 王翠平

摘 要： 以宁夏枸杞新品种‘宁杞8号幼嫩叶片为外植体， 探讨激素组合及添加物对‘宁杞8号体细胞胚胎诱导、体胚增殖、萌发和植株再生的影响，并建立高效稳定的体细胞胚胎发生体系。结果表明：通过对6-BA、2，4-D和IAA进行正交分析，筛选出‘宁杞8号体细胞胚诱导最优激素组合：6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1，体胚诱导率达88.67%。极差分析比较各激素间的影响，6-BA对体胚诱导影响最显著。当高浓度的生长素及低浓度细胞分裂素浓度适宜的配比时，才能诱导产生形态正常数量多的‘宁杞8号体细胞胚。在体胚增殖培养中，6-BA的浓度过高易导致玻璃化，不利于‘宁杞8号体胚增殖生长。随着激素浓度的增高，体胚增殖倍数增加，玻璃化率也越高，综合分析得到‘宁杞8号最佳体胚增殖培养基为6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1。当添加IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1时，‘宁杞8号体胚萌发率最高，萌发率达89.17%。添加GA3及低浓度蔗糖能促进成熟的体胚萌发。对‘宁杞8号体萌发的影响程度依次是IBA> 蔗糖 > GA3。活性炭能有效提高‘寧杞8号体胚再生植株率，同时对萌发体胚的根的发育也有促进作用，当IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1时，‘宁杞8号体胚再生植株效果最佳，体胚再生率达91.67%。

关键词： ‘宁杞8号， 体细胞胚胎发生， 体胚诱导增殖， 体胚萌发， 植株再生

中图分类号： Q945 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1183-08

Abstract： In order to establish a high-frequency regeneration system for Lycium barbarum. The leaf of L. barbarum ‘Ningqi-8 was selected as material to explore the crucial effects of hormone combinations and additives on the induction of somatic embryogenesis， somatic embryo proliferation and germination and plant regeneration. The results showed that by orthogonal analysis of 6-BA， 2，4-D and IAA， the optimal hormone combination of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryos was 6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1， the highest induction rate could get to 88.67%. Range analysis showed that 6-BA had the most significant effect on somatic embryogenesis. Using suitable proportion of hormone combination was possible to induce somatic embryogenesis of L. barbarum ‘Ningqi-8， which had a large number of normal morphology. In the culture of somatic embryos， the high concentration of 6-BA was easy to cause vitrification， which was not conducive to the growth and proliferation of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryos. The proliferation rate of somatic embryos increased with the increase of hormone concentration， and the vitrification rate increased， too. Then the most efficient proliferation medium for L. barbarum ‘Ningqi-8 was 6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1， and the highest germination rate of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryo was obtained when IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+ sucrose 10 g·L-1 was added. The highest germination rate could get to 89.17%， and the degree of influence on the germination of L. barbarum ‘Ningqi-8 was IBA > sucrose > GA3. Adding GA3 and low concentration sucrose could promote the mature somatic embryo germination. Activated carbon could effectively improve the regeneration rate of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryo， and simultaneously promote the development of the root of germination embryo. IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+ activated carbon 1 g·L-1 was found to be the suitable medium for regeneration in which L. barbarum ‘Ningqi-8 demonstrated the highest multiplying capacity， and the regeneration rate could get to 91.67%.

Key words： Lycium barbarum ‘Ningqi-8， somatic embryogenesis， somatic embryo induction and proliferation， somatic embryo germination， plant regeneration

宁夏枸杞（Lycium barbarum）属于茄科枸杞属，多年生分枝灌木，具有很高的药用价值和生态价值。随着宁夏枸杞药用保健方面的深入发掘，种植面积逐年增加，用途单一的枸杞品种很难满足加工企业的需求，要培育用途广泛的枸杞新品种，以满足生产加工的需要（何军等，2006）。杂交育种是运用最早且最为常规的育种手段，但其新品种育种年限长。植物体细胞胚具有单细胞起源、繁殖速度快、体胚个体间遗传背景一致、染色体稳定等特点，是开展植物细胞工程育种中遗传转化、种质保存、人工种子等研究工作的关键环节，也是悬浮细胞系建立、细胞突变体诱导与筛选、原生质体培养与融合等诸多生物技术應用的基础。枸杞体细胞胚胎发生体系的建立将为宁夏枸杞生物技术育种提供良好的平台，同时有助于加快生物技术在宁夏枸杞品种改良方面的应用。

曹有龙等（1997）以‘宁杞1号髓部组织为材料， 通过悬浮培养诱导胚状体发生。马和平等（2005）对‘宁杞 2 号幼果未成熟胚进行体细胞胚胎诱导，探讨了激素、光照及温度对体胚发生及植株再生的影响。王兆宾等（2014）以‘宁杞1号‘宁杞2号‘宁杞4号及新疆枸杞种子为外植体，构建了体细胞胚高频发生再生体系。这些报道为枸杞体细胞发生体系的建立提供了借鉴。然而，由于基因型的差异，体细胞胚发生体系建立的最优条件在枸杞不同品种间存在较大差异。‘宁杞8号是通过自然选优的方式获得的大果宁夏枸杞新品种，具有生长旺盛、果粒大、果实营养成分高等优良特性（南雄雄等，2014）。‘宁杞8号单个果实纵径可达4.3 cm，是‘宁杞1号等品种的两倍，但目前有关‘宁杞8号体胚发生的相关研究尚未见有报道。‘宁杞8号体细胞胚胎发生体系的建立，为枸杞品种改良和新品种选育提供新途径，不受时间和空间的限制，同时短时间大量繁殖，加快优良品种的繁育，满足新品种工厂化生产。国内更多研究是以枸杞胚乳、种子、子叶及下胚轴等为外植体进行体胚诱导，对于叶片诱导研究较少。

利用枸杞叶片进行体胚诱导取材更为方便，还能较大地保存植株的遗传特性。因此，本研究以宁夏枸杞新品种‘宁杞8号叶片为外植体，探索不同种类及浓度的附加物对体细胞胚胎发生的影响，旨在建立体细胞胚胎发生体系，也为宁夏枸杞生物技术育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用外植体材料为宁夏枸杞新品种‘宁杞8号顶梢幼嫩叶片，采自宁夏林业研究院枸杞种质资源圃。该品种于2012年通过国家植物新品种保护，2015年通过宁夏自治区林木良种审定。

1.2 方法

1.2.1 ‘宁杞8号体细胞胚诱导 采取健壮无病虫害的‘宁杞8号的幼嫩叶片，自来水冲洗30 min，在超净工作台上，先用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗3～4遍。再用0.1%的HgCl2溶液处理3～4 min，无菌水冲洗3～4次后，将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，接种于诱导培养基中。采用L9 （34 ） 正交设计，研究6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）、2，4-D（0.3、0.6、0.9 mg·L-1）、IAA（0.2、0.4、0.6 mg·L-1）对‘宁杞 8 号体细胞胚胎诱导的影响，共9个处理， 基本培养基为MS培养基+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1。每处理10瓶，每瓶5个外植体，每处理重复3次。培养40 d后，统计体胚诱导率及体胚的生长情况。培养温度23～25 ℃，光照 16 h·d-1，光照强度2 000 lx，培养方式下同。

1.2.2 ‘宁杞8号体胚增殖培养 采用二因素完全随机试验设计，探究6-BA（0.4、0.8 mg·L-1）和NAA（0.2、0.4、0.6 mg·L-1）对 ‘宁杞8号体胚增殖的影响，共设6个处理，基本培养基为MS培养基+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1。取‘宁杞8号生长正常的体胚组织块，切成0.2 cm × 0.3 cm小块接种于上述体胚增殖试验培养基内。每处理10瓶，每瓶5个体胚块，重复3次。培养40 d后统计增体胚再生率和增殖倍数。

1.2.3 ‘宁杞8号体细胞胚萌发 研究IBA、GA3、蔗糖对‘宁杞8号体胚萌发的影响，采用L9 （34）正交设计，即A.IBA（浓度为0.1、0.2、0.3 mg·L-1），B.GA3（浓度为0.2、0.4、0.6 mg·L-1），C.蔗糖（浓度为10、20、30 g·L-1），MS为基本培养基。将成熟体胚分别接种于上述试验处理中，每处理10瓶，每瓶4个成熟体胚，重复3次。培养30 d后，统计体胚萌发率，记录体胚萌发生长状况。

1.2.4 ‘宁杞8号体胚完整植株再生 添加 0.1、0.3 mg·L-1的IBA和0.2、0.4 mg·L-1的KT，同时又分为①不添加活性炭，②添加1 g·L-1活性炭两组，共设8个处理（表4），基本培养基为MS培养基+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1。将长有胚根的体胚接种于上述培养基中，每处理10瓶，每瓶4个材料，重复3次，培养25 d后，记录植株再生率、植株的生长情况及芽增殖系数。

1.2.5 数据处理与统计 体胚诱导率=生成体胚叶片数/接种的叶片总数×100%； 体胚增殖倍数=叶片体胚团产生新的体胚数/该处理接种的体胚数； 体胚玻璃化率=新增殖体胚中的玻璃化体胚数/供试体胚总数×100%； 体胚萌发率=生根的体胚数/供萌发试验的体胚总数×100%； 再生植株率=根芽完整的植株/供试的体胚总数×100%； 芽增殖系数=体胚产生的芽数/供试接种数。用DPS数据处理系统进行数据分析，Duncans检验显著性。

2 结果与分析

2.1 激素对‘宁杞8号体细胞胚胎诱导的影响

根据表1中K值的大小，通过6-BA、KT、NAA各因素水平间的比较，6-BA在1.0 mg·L-1时为最优，2，4-D 在0.3 mg·L-1时为最优，IAA在0.4 mg·L-1时为最优，可得出‘宁杞 8 号体细胞胚诱导最优激素组合6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1，即处理4。处理4体胚诱导率最高，达到了88.67%，说明处理4对诱导体胚发生效果最好，这一结果与K值分析结果一致。综合以上分析结果，可以确定‘宁杞 8 号体细胞胚诱导最佳组合为6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1。极差值R越大，说明该因素对指标的影响越显著，从表1可以看出，6-BA的R值最大，说明在本研究中6-BA为主导因素，对‘宁杞 8 号体细胞胚诱导的影响最大，在这三个因素中，根据R值的大小，对‘宁杞8号体细胞胚诱导的影响程度依次是6-BA > IAA >2，4-D。

2.2‘宁杞 8 号体胚发育不同阶段形态观察

‘宁杞8号体胚诱导培养过程中，10 d后叶片逐渐膨大，叶面拱起。15 d膨大的叶片切口处生成许多密集小突起，呈现绿色球形小点（图1： A）。培养20 d后，逐渐生成细胞团，呈不规则形态。培养25 d后，细胞团不断增殖，包围整个胚体。通过显微观察发现，清晰可见许多发育良好的球形胚（图1： B）、心形胚（图1： C）和鱼雷胚（图1： D）。球形胚因形态较大，肉眼可见。随着发育程度的变化，同一体胚团块能观察到各个时期的体胚同时存在，以球形胚居多，可见鱼雷胚和发育较快的子叶胚，并有绿色或紫红色芽出现（图1： E）。随着胚状体逐渐成熟，萌发体胚团块上生长大量胚根（图1： F）。

2.3 6-BA和NAA对‘宁杞8号体胚增殖的影响

从表2可以看出，当6-BA浓度不变时，随着NAA浓度的升高，体胚增殖倍数逐渐增加，在处理6中6-BA为0.8 mg·L-1、NAA为0.6 mg·L-1时，体胚增殖倍数最高（达13.22），其玻璃化率也达到最高。在体胚增殖培养中，不是激素浓度越高越好，6-BA的浓度过高易导致玻璃化，不利于‘宁杞8号体胚增殖生长。当降低6-BA浓度（为0.6 mg·L-1）时，即处理3。处理3体胚增殖倍数为12.28，在P=0.05水平下与处理6差异不显著，体胚玻璃化率明显低于处理6，差异显著，且处理3体胚玻璃化率与处理1、处理2差异不显著。因此，综合分析可得，最优‘宁杞8号体胚增殖的配方为6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1，即处理3。

2.4 激素和蔗糖对‘宁杞8号体胚萌发的影响

‘宁杞8号体胚萌发统计结果见表3，8号处理体胚萌发率最高（达89.17%），体胚萌发效果最佳且差异显著。从表3中的K值大小可以看出，IBA为0.3 mg·L-1、GA3为0.4 mg·L-1时，蔗糖在10 g·L-1时为最优，可得出‘宁杞8号体胚萌发最优激素组合为IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1，即处理8，这与试验数据所得结果一致，可确定该组合是‘宁杞8号体胚萌发最佳激素配方。IBA的R值最大，说明‘宁杞8号体胚萌发中IBA为主导因素，对‘宁杞8号体胚萌发的影响最大。根据R值的大小，对‘宁杞8号体胚萌发的影响程度依次是IBA>蔗糖>GA3。

2.5 激素及活性炭对‘宁杞8号体胚植株再生的影响

由表4可知，添加活性炭对‘宁杞8号体胚植株再生有显著效果，植株再生率、新生根数、根长及芽增殖系数添加活性炭的处理组都高于未添加活性炭的处理组，说明添加活性炭有利于‘宁杞8号体胚植株再生。在IBA 0.1 mg·L-1的浓度处理下，KT 0.4 mg·L-1处理对‘宁杞8号体胚植株再生的效果要优于KT 0.2 mg·L-1处理，当提高IBA浓度（为0.3 mg·L-1）时，KT 0.2 mg·L-1处理效果优于KT 0.4 mg·L-1处理，说明生长素和细胞分裂素在一定的比例配比下，更有利于‘宁杞8号体胚植株再生，不是配比越高生长情况越好。综上所述，IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1为‘宁杞8号体胚植株再生最优组合，即处理4，此时植株再生率最高（达91.67%）。

3 讨论与结论

在植物体细胞胚胎发生过程中，植物生长调节剂是诱导体细胞胚胎发生最活跃的因子，体胚发生不同阶段所需植物生长调节剂种类和浓度存在差异。本研究结果表明，当高浓度的生长素及低浓度细胞分裂素浓度适宜的配比时，才能诱导产生形态正常数量多的‘宁杞8号体细胞胚。当6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1时，‘宁杞8号体胚诱导率最高，达88.67%，诱导效果最佳，但6-BA浓度过高，反而抑制了体胚的生成。对‘宁杞8号体细胞胚诱导各激素效应由大到小依次为6-BA> IAA >2，4-D，其中6-BA的影响最显著。张新宁等（1996）研究也有与本研究相同的发现，枸杞幼胚接种在含6-BA 0.5～1.0 mg·L-1和IAA 0.5 mg·L-1两种激素的培养基上进行培养，幼胚胚性愈伤组织的发生率最高。罗青等（2016）通过对枸杞花药进行培养试验指出6-BA和NAA配合使用，胚性愈伤组织分化频率最高，与本研究结果相比较，在激素种类，浓度选择上有着相似的地方。大多数植物细胞在离体培养条件下诱导胚性细胞的发生必须在含有2，4-D的条件下，并认为2，4-D对内源生长素的调节和平衡起重要作用（张涛，2007）。张波等（2016）研究中指出，枸杞花药在2，4-D 0.2 mg·L-1体胚诱导效果最佳。这和本研究添加2，4-D 0.3 mg·L-1体胚诱导效果最佳结果相似，但由于品种和外植体种类的不同，2，4-D最适宜浓度略有不同。枸杞体胚诱导材料主要有胚乳、种子、子叶、花药、花粉及下胚轴等，本实验以枸杞叶片为外植体，与以往枸杞体胚诱导方式相比取材更为方便，数量也比较多，可以随时采集，在本實验筛选的最适宜三种激素配比下，枸杞体细胞胚诱导率远高于胚乳、种子、子叶、花药、花粉及下胚轴等材料体胚诱导率。

体细胞胚通过增殖，能获得大量形态正常的体胚，为体胚萌发及植株再生研究提供材料。通过6-BA和NAA配比对‘宁杞8号体胚增殖倍数影响进行研究，当6-BA浓度达到0.8 mg·L-1，NAA 0.6 mg·L-1时，体胚增殖能力最强，玻璃化率也最高，当6-BA 0.4 mg·L-1，NAA 0.6 mg·L-1时，体胚增殖能力较强，玻璃化率明显降低。综合分析得到6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.6 mg·L-1为最优‘宁杞8号体胚增殖培养基。潘珺等（2018）在抗性赤松体胚增殖条件优化研究中发现，添加适宜浓度的NAA和6-BA能够有效提高体胚增殖速度，对抗性赤松体胚增殖影响显著，这与本研究的结果一致。在‘宁杞8号体胚增殖过程中，各处理都出现了玻璃化现象，‘宁杞8号体胚增殖玻璃化控制还需进一步研究。此外，本研究所取增殖的外植体为体胚发育的各个时期，‘宁杞8号体胚具体哪个发育时期更有利于体胚增殖也有待进一步的研究。

体胚的成熟、萌发和转化是一种相互依赖的关系。成熟是萌发和转化的基础，只有形态和生理上都成熟的体胚才能顺利进行随后的萌发和转化。GA3在体细胞胚进一步的发育成熟、刺激胚根生长和形成完整小植株中起重要的作用（Evans，1983）。低浓度蔗糖，胚性愈伤停留在组织阶段，球形胚甚少，但愈伤组织量多，再生能力强，而且正常苗比例高（Abdoulaye & Mark，2006）。蒋菁等（2013）通过研究发现，成苗培养基中添加GA3利于促进体细胞胚诱导成苗，GA3对花生的体胚萌发与植株再生有促进作用。赵苹静（2009）研究中同样也指出在添加GA3及低蔗糖浓度条件下，能促进成熟的体胚萌发。本研究通过对IBA、蔗糖和GA3进行三因素三水平的正交试验，筛选出‘宁杞8号体胚萌发最优激素组合为IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1，其体胚萌发率高达89.17%，与上述观点一致。培养基中添加活性炭有利于体胚的成熟发育（王丽和张焕玲，2016）。本研究结果也表明，在‘宁杞8号植株再生培养基中添加适量活性炭，能有效提高体胚萌发后再生植株率，活性炭对萌发体胚根的发育也有促进作用。IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1为‘宁杞8号体胚植株再生最优组合。王晓春等（2004）在大豆体细胞胚研究中也同样得出，添加适量的活性碳促进体胚萌发成正常苗，且促进根系生长，幼苗健壮。活性炭能吸收培养基中组织产生的抑制胚胎发生的物质及多余的激素，通过调整激素浓度的配比而促进体胚的正常发育（袁澍等，2003）。

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