HPSEC—ELSD法同时测定白及多糖的分子量和含量

王川 张燕 李楠 李雅丽 刘江云 蔡培烈 郝丽莉

中图分类号 R284.1；R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）09-1198-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.11

摘 要 目的：建立同时测定白及多糖的分子量及其含量的方法。方法：采用高效分子排阻色谱-蒸发光散射检测（HPSEC-ELSD）法。色谱柱为TSK-GEL G4000 PWXL，流动相为纯水，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μL，采用蒸发光散射检测器。采用建立的方法测定3批白及多糖的分子量及其含量。结果：白及多糖的重均分子量测定线性范围为24.17～178.00 kD（R2=0.985 5），BT07含量测定线性范围为0.508 0～5.080 mg/mL（R2=0.998 4），检测限、定量限分别为0.116 5 、0.274 0 mg/mL，精密度、稳定性、重复性试验的RSD 均<2%（n=6或n=7）；白及多糖样品含量测定平均加样回收率为99.16%～100.20%（RSD=0.39%～0.64%，n=9）。3批样品的平均保留时间为14.28 min （RSD=4.35%，n=3），平均重均分子量为23.54 kD（RSD=3.78%，n=3），多分散系数（D，MW/Mn）范围为1.463～1.578，样品平均含量为93.4%（RSD=4.22%，n=3）。结论：建立的HPSEC-ELSD法操作简便 、快速，结果准确可靠，可同时测定白及多糖的分子量和含量。

关键词 白及；多糖；高效分子排阻色谱-蒸发光散射检测法；分子量；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To set up a method for determination of molecular weight and content of polysaccharide in Bletilla striata. METHODS： HPSEC-ELSD method was adopted. The determination was performed on TSK-GEL G4000 PWXL column with mobile phase consisted of pure water at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 20 μL. Evaporative light scattering detector was used. The molecular weight and content of polysaccharide in 3 batches of B. striata were established. RESULTS： The linear range of weight average molecular weight of B. striata polysaccharide were 24.17-178.00 kD（R2=0.985 5）. The linear range of BT07 content determination were 0.508 0-5.080 mg/mL（R2=0.998 4）. The limits of detection and quantitation were 0.116 5 and 0.274 0 mg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6 or n=7）. Average recoveries rate were 99.16%-100.20% （RSD=0.39%-0.64%，n=9）. Average retention time of 3 batches of samples was 14.28 min （RSD=4.35%， n=3）， and weight average molecular weight was 23.54 kD （RSD=3.78%，n=3）. Polydispersity coefficient D，MW/Mn）ranged 1.463-1.578. Average content of sample was 93.4% （RSD=4.22%， n=3）. CONCLUSIONS： HPSEC-ELSD method is simple， rapid， accurate and reliable， which can be used for simultaneous determination of B. striata polysaccharide.

KEYWORDS Bletilla striata； Polysaccharide； HPSEC-ELSD； Molecular weight； Content

多糖是自然界生物中廣泛分布、用途广泛的一类高分子聚合物，同时也是灵芝、铁皮石斛、黄精、枸杞子等众多常用中药的有效成分之一[1]。由于多糖的结构复杂而且存在微观不均一性，其分子量及其分布主要采用高效分子排阻色谱（HPSEC）法测定[2]。由于糖类分子结构中缺乏发色团，常规采用间接方法例如多糖经完全酸水解、衍生化反应后再选用比色法、气相法、液相法等对其单糖组成和含量进行测定。中药白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.]药用部位为其块茎，具有收敛止血、补肺、消肿生肌之功效，用于咯血、吐血、外伤出血、皮肤皴裂等病症。白及中含有多种特征性的菲类衍生物、有机酚酸等复杂成分和多糖，其中白及多糖是其主要有效成分之一[3-4]。白及多糖的含量测定常规选用比色法，但该法测定的是总糖含量，不能区别单糖和多糖纯度[5-6]。本课题组曾选用示差检测器，采用HPSEC法可以直接同时测定白及多糖分子量及其含量[7]，但该检测器灵敏度相对较低，检测时容易受到流动相组成、柱温、样品中其他杂质等干扰。为此，本文参考相关文献[8-12]，采用HPSEC联用蒸发光散射检测器（ELSD）法进一步优化测定白及多糖的分子量及其含量的方法，为其质量控制方法提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）； 2000 ELSD（美国奥泰公司）；EC2000 GPC软件（大连依利特分析仪器有限公司）；XWK-3A空气泵（天津市华生分析仪器厂）；ME215S电子天平（德国Starorious公司）；MP2002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

已知分子量的白及多糖BT01～BT07 7个对照品（本实验室自制，纯度：均>95%），其分子量参数重均分子量（MW）、数均分子量（Mn）、多分散系数（D，MW/Mn）采用多角激光光散射法测定（表1）[7，13]；葡聚糖T-2000（批号：17-0330-01，纯度：95.4%）购自北京拜尔迪生物公司。无水葡萄糖（批号：20130111，分析纯，纯度：98.2%）购自上海国药集团化学试剂有限公司；水为纯水；白及根茎（批号：BS171001）购自云南普洱市玉林林业开发有限公司。白及多糖试制样品BP-1～BP-3（批号：BP171001、BP171101、BP171102），由本实验室自制[13]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：TSK- GEL G4000 PWXL（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流动相：纯水；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；ELSD检测器。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取白及多糖对照品BT01～BT07、葡聚糖T-2000、葡萄糖各10 mg，置于10 mL量瓶中，用水加热溶解，定容，即得。精密称取BT07对照品101.61 mg，置于20 mL量瓶中，用適量水加热溶解，定容，即得BT07贮备液（5.080 mg/mL）。

2.2.2 供试样品 取白及药材（100 g）于沸水中回流提取1.5 h（1 L×2），加入两倍无水乙醇使沉淀，抽滤，干燥，得白及多糖提取物（15.6 g）。取所得白及多糖（2.0 g）溶于96 mL水中，加入4 mL 0.10 mol/L 盐酸，于90 ℃水浴恒温酸水解3.5 h，用1 mol/L 氢氧化钠调pH至6～7，过滤，滤液加入200 mL无水乙醇使沉淀，抽滤，60 ℃干燥，得白及多糖试样BP-1（1.24 g）。同法制备获得试样BP-2和BP-3。

2.2.3 供试品溶液 精密称取试样BP-1～BP-3各约20 mg，置于10 mL量瓶中，分别加入适量水加热溶解，定容，即得。

2.3 系统适用性试验

根据分子排阻色谱的要求，测定样品的保留时间应在最大分子量和最小分子量对照品之间；应选择与测定样品结构和分子量最相近的对照品[2]。在此色谱条件下，测定葡聚糖T-2000、葡萄糖的保留时间（tR）分别为8.38、17.54 min，葡萄糖理论板数为5 685。系列白及多糖对照品tR值均在该范围内，方法可行。代表性对照品BT07与样品BP-1的色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

2.4.1 分子量线性关系的建立 吸取“2.2.1”项下BT01～BT07对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰tR，结果见表1。以tR为横坐标，对照品Mw的对数值（lgMw）为纵坐标，计算回归方程为lgMw=-0.224 4tR+4.574 9（R2=0.985 5）。结果表明，在该色谱条件下白及多糖分子量线性关系良好（Mw 24.17～178.0 kD）。

2.4.2 BT07含量线性关系 精密量取BT07贮备液（5.080 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，用水稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱峰面积A。以质量浓度的对数值为横坐标（x），以峰面积A的对数值为纵坐标（y）进行线性回归，获得两者之间的线性回归方程为y=1.492 4x+0.748 2（R2=0.998 4）。结果表明，BT07在该色谱条件下含量与峰面积线性关系良好，线性范围为0.508 0～5.080 mg/mL。

2.5 检测限与定量限考察

取“2.4.2”项下BT07对照品溶液（1.016、2.032、3.048、4.064 mg/mL）各0.5 mL，分别置于5 mL量瓶中，用水稀释至刻度，制得一系列质量浓度BT07溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰峰高H。当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限质量浓度为0.116 5 mg/mL；当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限质量浓度为0.274 0 mg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下BT07对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱峰tR和峰面积A。计算得到BT07平均tR为 14.28 min（RSD=0.54%，n=6），平均A为1.314×107（RSD=1.67%，n=6）。结果表明，该法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取BP-1供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12 h时，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰tR、峰面积A。计算得到BP-1平均tR为 14.25 min（RSD=0.94%，n=7），平均A为1.345×107（RSD=1.69%，n=7）。结果表明，该法12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取BP-1供试品，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰tR、峰面积A。计算得到BP-1平均tR为14.22 min（RSD=0.83%，n=6），平均A值为1.392×107（RSD=1.41%，n=6）。结果表明，该法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

分别精密称取10 mg BP-1供试品9份，加入到5 mL量瓶中，再精密加入配制好的BT07对照品溶液（10.05 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL各3份，加入适量水加热溶解，定容。按“2.1”项下色谱条件进样分析，并计算加样回收率。结果表明，低、中、高3种加入量的回收率分别为99.16%、100.20%、99.91%，RSD分别为0.64%、0.64%、0.39%（n=3），见表2。

2.10 样品测定

取BP-1～BP-3共3批次样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰保留时间tR、峰面积A，计算各批次样品的MW和含量。结果，BP-1～BP-3样品的平均tR为14.28 min（RSD=4.35%，n=3），平均MW为23.54 kD（RSD=3.78%，n=3），D值范围1.463～1.578，样品平均含量为93.4%（RSD=4.22%，n=3）。表明所建立的分析方法适用于该样品分子量和含量分析。

3 讨论

ELSD是一种通用性质量分析检测器，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高等优点，流动相可以进行梯度洗脱，尤其适用于复杂多组分的分析[14-16]。近年来，HPSEC色谱在麦冬、甘草等植物多糖的定性定量分析中也获得成功应用[8-12]。本文研究结果表明，该法可直接测定白及多糖分子量及其含量，同时不同分子量规格的多糖也可获得有效分离，方法简便、快捷，准确度高，适用于白及多糖的分析。

对缺乏紫外特征吸收的糖和苷类等成分分析，常规可选用示差检测器和ELSD等质量型检测器。传统糖类检测中使用的示差检测器容易受环境温度、流动相组成、柱温、样品中其他杂质等干扰。故本试验中，采用ELSD法对白及多糖進行检测，检测限为0.116 5 mg/mL，比前期所用的示差检测器检测限（1.133 mg/mL）[5]约高10倍，表明本法灵敏度较高，在应用于生物样品分析中具有一定优势。此外，HPSEC分析方法中所用色谱柱的适用分子量测定范围、样品浓度、流动相选择等影响因素也很重要，应在方法学研究中进行考察和优化。

综上，本研究建立的方法操作简便 、快速，结果准确可靠，可同时测定白及多糖的分子量和含量。

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（收稿日期：2018-02-06 修回日期：2018-03-15）

（编辑：余庆华）