鱼类肽聚糖识别蛋白的研究进展

夏洪丽 程俊 喻大鹏 陈文捷，4 鲁义善

（1. 广东海洋大学深圳研究院，深圳 518116；2. 广东海洋大学水产学院，湛江 524003；3. 广东省水生动物健康评估工程技术研究中心，深圳 518116；4.中国科学院水生生物研究所，武汉 430072）

近年来，我国水产养殖业发展迅速，养殖业面临的诸多问题也日益突出，尤其是病原感染引起的水产病害，给养殖业造成了巨大的经济损失。疾病的发生是由病原、宿主和环境三者相互作用的结果，其中宿主的免疫应答对抵御病原微生物的感染具有重要作用，因此研究鱼类免疫应答机制一直是学术界的热点，特别是在胚胎发育早期发挥关键作用的先天性免疫。肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）作为一种重要的模式识别受体，在鱼类抵御病原侵染过程中扮演着十分重要的角色。目前有关鱼类PGRPs的研究已经取得了一定的进展，本文综述了鱼类PGRPs的结构、表达及其功能，旨在为鱼类先天性免疫的研究提供理论参考。

1 PGRPs的发现

肽聚糖识别蛋白（Eptidoglycan recognition proteins，PGRPs）是一类可识别肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）的模式识别受体家族，最早发现于家蚕血淋巴中［1］。随后，在昆虫［2］、棘皮动物［3］和脊椎动物［4-5］中相继被发现。目前已报道的鱼类PGRP共23种（表1）。根据氨基酸序列的不同，PGRPs主要分为3类：短型PGRPs（Short-PGRPs，PGRP-S）、中型 PGRPs（Intermediate-PGRPs，PGRP-I）和长型PGRPs（Long-PGRPs，PGRP-L）［6］。果蝇 PGRPs主要分为两类：一类是较短的转录产物，包括PGRPSA、-SB1、-SB2、-SC1A、-SC1B、-SC2和-SD；另一类是较长的转录产物，包括PGRP-LAa、-LAb、-LAc、-LB、-LCa、-LCx、-LCy、-LD、-LE 和 -LF［5，7］。哺乳动物PGRPs有不同的转录产物：PGRP-S、PGRP-Iα、PGRP-Iβ 和 PGRP-L，也称为 PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3 和 PGLYRP-4［3，8］。 迄 今，在包括斑马鱼（Danio rerio）［9-11］、岩鱼（Sebastes schlegeli）［12］、 美 国 红 鱼（Sciaenops ocellatus）［13］、草 鱼（Ctenopharyngodon idella）［14-16］、 斑 点 叉 尾鮰（Ictalurus punctatus）［17］、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［18］、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［19］、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［20-21］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［22］、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）［23］和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）［24］等鱼类中发现3类PGRPs，其中PGLYRP-2与哺乳类PGLYRP-2为同源物，而PGLYRP-5（也称为PGRPSC）和PGLYRP-6则是鱼类所特有的［17］。

表1 11种硬骨鱼的肽聚糖识别蛋白

2 PGRPs的结构与表达

在结构上，所有PGRPs的C端通常包含至少一个高度保守的PGRP结构域，与噬菌体T7溶菌酶和细菌的II型酰胺酶有一定的相似性，而PGRPs在N端的序列长度差异较大，在不同生物间并不保守［3］。人类PGRPs都含有信号肽结构，而信号肽是蛋白质经典分泌途径的关键结构；然而，斑马鱼PGRP2，PGRP5并不含信号肽结构，但斑马鱼PGRPs也均是分泌蛋白［5，25-26］，其机制尚不明确。尽管鱼类PGRPs在大小、结构域布局及亚细胞定位方面有一定差异，但其C端的PGRP结构域是高度保守的。哺乳动物PGRP结构域的空间构象是由位于中心的几个 β 片层和外围的 3 个 α 螺旋（α1-α3）组成［27］。研究表明，鱼类PGRPs也有类似的结构，而个别剪切体因某个氨基酸位点的缺失，导致结构上稍有不同［9，16，24］。

PGRP结构域都含有高度保守的半胱氨酸位点，其形成的二硫键是赋予PGRPs功能活性和维持蛋白结构稳定所必须的重要结构［28］。研究表明，该结构域中的某半胱氨酸位点突变将使其丧失酰胺酶活性［29-31］。晶体结构显示，PGRP结构域构象的正面凹槽含有保守的Zn2+结合位点，由两个组氨酸、一个酪氨酸和一个半胱氨酸组成，是结合肽聚糖的活性中心；其另一面为PGRP特异，且不保守的疏水区域，不同于催化酰胺键水解反应的II型酰胺酶结构［31-34］。研究表明，结合PGN的凹槽结构被破坏后，将使其无法识别PGN，从而失去酰胺酶活性［29-30］。通过多重序列比对发现，鱼类PGRPs基本也都含有4个Zn2+结合位点，如图1所示。说明鱼类PGRPs与哺乳动物可能有类似的功能，但其作用机制是否也依赖于半胱氨酸残基还有待进一步研究。

鱼类PGRPs在不同器官/组织中广泛表达，但其表达组织和表达量都存在明显差异。与斑马鱼PGRP2类似，美国红鱼、大黄鱼和大菱鲆PGRP2在各组织中普遍存在，尤其在肝脏中表达量最高［9，13，18，22］。岩鱼 PGRP-L1 在肠和脾脏中表达量较高；其次是鳃和皮肤等，而PGRP-L2仅在肝脏中表达［12］。实验表明，在不同细菌的刺激下，鱼类PGRPs在各免疫组织的表达量均明显改变。因此推测鱼类PGRPs参与了机体的免疫应答过程，且发挥效应的部位各不相同，如草鱼PGRP6a、PGRP6d通过鳃和皮肤发挥作用，而PGRP6b的效应部位是肠，脾脏和肝脏等［16］。鱼类PGRPs的广泛表达将有利于机体及时将体内感染的病原体清除。同时，在非免疫组织中的表达说明PGRPs在生理过程过可能也扮演着重要角色。此外，实验表明，鱼类PGRPs在胚胎发育早期阶段的先天性免疫中发挥着关键作用［18，26］。

图1 鱼类肽聚糖识别蛋白的多序列比对结果

3 PGRPs的进化

利用生物信息学软件 Clustalx 和 MEGA5.0构建了N -J（Neighbor-joining）进化树，对来自人类、小鼠、原鸡、非洲爪蟾和斑马鱼等14个物种（表2）的PGRPs 的进化关系进行分析，结果表明，不同物种的PGRP-S和 PGRP-L分别独立进化，即同种类型PGRPs聚为一支，而与本物种的其他类型PGRPs同源性相对较低，这与以往的报道高度一致［3，35］（图 2）。

表2 14个物种的肽聚糖识别蛋白

4 PGRPs的功能

4.1 病原识别能力

PGN是几乎所有细菌细胞壁的主要成分，包括L-赖氨酸（Lys型）和二氨基庚二酸（Dap型）两种类型，Lys 型 PGN主要存在于革兰氏阳性菌中，而Dap 型 PGN 是革兰氏阴性菌的主要组成成分［36］。当细菌或其他含PGN的外源物体侵染机体时，能被宿主PGRPs识别并与之结合，从而激发机体的免疫效应。人PGLYRP3结合PGN后，其PGRP结构域的构象随即发生改变，将目标物固定在凹槽内，提高结合过程的亲和力［34，36-38］。研究表明，鱼类PGRPs能够结合 Lys型和 Dap 型两种 PGN［14-15，26］。除了PGN以外，人和鼠PGRPs还能够结合脂膦壁酸（LTA），脂多糖（LPS）等聚合物，但对后两者的亲和力明显较低，但猪PGLYRP1对LTA和LPS有很强的亲和力［39-41］。根据文献报道，PGN、脂膦壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）和Ploy I：C均能够诱导草鱼PGRP5和PGRP6的高表达［14-16］。说明草鱼PGRP5、PGRP6与哺乳动物PGRPs类似，能够识别不同的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），至于其相互作用的亲和力是否有差异，还有待进一步的研究。

4.2 酰胺酶活性

PGRPs能够水解细菌肽聚糖中N -乙酰胞壁酸与 L-丙氨酸之间的酰胺键，将有活性肽聚糖的分子片段化，从而使其失去活性，达到清除细菌的目的［31，42］。人 PGLYRPs中，仅 PGLYRP2具有酰胺酶活性［36］。研究表明，保守的Zn2+结合位点对于PGRPs发挥酰胺酶活性是必须的［33-34］。如图2所示，鱼类PGRPs的C端含有保守的半胱氨酸残基，暗示其和人PGLYRP2一样，都具有酰胺酶活性。文献报道多种鱼类的PGRPs都具有酰胺酶活性，且呈Zn2+依赖性［11-15，23-24］，2012 年，孙黎等克隆美国红鱼PGLYRP2和PGLYRP2-AD（酰胺酶结构域），分别进行原核表达，分离纯化重组蛋白，并进行枯草芽孢杆菌肽聚糖的水解实验，结果显示，PGLYRP2和PGLYRP2-AD都具有酰胺酶活性，水解肽聚糖［13］。

4.3 杀菌、抑菌活性

当PGRP与微生物细胞壁成分结合后形成复合物，能够激活酚氧化酶，经过一系列反应，将含酚的化合物氧化成醌，转换成黑色素将微生物包裹来限制其感染［2］。哺乳动物PGRPs只有酰胺酶活性或者杀菌活性，与PGLYRP2不同，人PGLYRP-1，PGLYRP-3，PGLYRP-4在对应Cys530位点上是丝氨酸而非半胱氨酸，无法结合Zn2+，因此PGLYRP-1，PGLYRP-3，PGLYRP-4 只有杀菌活性［30，43-44］。后两者形成的异二聚体PGLYRP3：4也同样有高效的杀菌作用［44］。研究表明，鱼类PGRPs同一分子往往兼具酰胺酶和杀菌两种特性［12，26］。除了酰胺酶活性以外，岩鱼PGRP-L1和PGRP-L2还具有广谱杀菌功能［12］。因此猜测PGRPs的杀菌机制与其自身的酰胺酶活性可能存在某种关联，但目前还没有相关的实验证实这一猜想。斑马鱼PGRPs不仅能有效杀灭革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌也表现出不同程度的杀菌作用。然而，美国红鱼PGLYRP2只对革兰氏阳性菌有很强的杀灭作用［13］。鱼类PGRPs在抗菌免疫中表现各异，即使同一物种的不同PGRPs分子的作用也不尽相同，至于其作用机制还有待进一步研究。

图2 PGRPs的系统进化树

4.4 免疫调节

PGRPs在免疫反应中发挥着重要作用，包括免疫调节过程［31，42，45］。除了识别病原体，PGRPs还通过调节机体免疫以便能够及时有效地清除入侵的病原体。研究表明，并非所有的PGRPs都有很强的杀菌作用。例如，半滑舌鳎PGRP-SC2并非是直接杀死细菌的效应物，而是通过提高细胞的吞噬能力来抑制机体内细菌的定植与传播［23］。与此类似，罗非鱼PGRP-SC2并未表现出明显的杀菌作用，却能显著降低靶器官内无乳链球菌的载量，说明其在抵抗无乳链球菌感染过程中扮演着重要角色［24］。

起初认为PGRPs是一个简单的效应分子，随着研究的深入，发现昆虫PGRPs能够激活Toll或IMD信号传导通路或诱导蛋白水解级联反应，从而提高抗菌免疫反应［45］。研究表明，鱼类PGRPs不仅是典型的模式识别受体，还可介导细胞内的Toll、MAPK、JAK/STAT和NF-KB多条信号通路，从而调节下游免疫相关基因的表达。由于昆虫PGRPs的水解肽聚糖的酰胺酶活性，可以防止机体出现过度炎症反应，因此推测哺乳动物PGRPs也有抗炎效应［42，46-47］。然而，与预期结果相反，实验表明哺乳动物PGLYRP2在PGN感染机体过程中发挥了促炎效应［48］。为探究鱼类 PGRPs的功能，Jang 等［20］通过构建酰胺酶失活突变体，发现虹鳟PGRP-L1能够抑制IL-1β和TNF-a等下游炎性因子的表达，说明虹鳟PGRP-L1发挥了抗炎功能，且该调节机制与其酰胺酶活性无关。此外，鱼类PGRPs能促进穿孔素、抗菌肽的分泌，从而在机体的抗菌免疫反应中发挥协同效应［16］。

选择性剪切是单个基因剪切合成多功能信使RNA的过程，是真核生物中普遍存在的一种现象，会影响免疫系统中关键蛋白的结构和功能［49］。草鱼PGRP6的不同剪切体虽然都能抑制体内细菌的增长，但其作用机制也各不相同。PGRP6a，PGRP6b和PGRP6c能诱导铁调素和G-溶菌酶的表达，而草鱼PGRP6和PGRP6d却无此功能。另外，4个剪切体中只有PGRP6c能够影响穿孔素的分泌，说明在抑菌活性的基础上，草鱼PGRP6的不同剪切体还有功能特异性［16］。

5 展望

PGRPs在机体先天性免疫过程中发挥着重要作用，目前有关鱼类PGRPs的研究已经取得了一定的进展，然而对其作用机制的研究还不够深入。PGRP-L的N端几乎占据整个分子的2/3，该段蛋白的结构差异较大的原因是什么，以及发挥的作用是怎样的；PGRPs的杀菌作用与酰胺酶活性是否存在一定的联系。以往的报道发现，PGRPs能够抵御真菌的感染，且软体动物PGRPs对寄生虫刺激也有一定的防御作用，那么鱼类PGRPs是否也有类似的功能。

免疫信号通路是一个十分复杂的网络。PGRPs作为分泌蛋白，却能显著抑制NF-kB活性，因此，推测细胞内可能存在某种表面受体来协助PGRP完成信号的转导，至于受体是什么又是如何发挥作用的，就不得而知了。研究表明，虹鳟PGRP-L1和核苷酸结合寡聚化结构域（Nucleotide-binding oligomerization domains，NODs）在抗菌免疫应答中存在相互依赖，并能够调节部分炎症因子的表达，但对IL-10的表达却没有任何影响［50］。那么PGRPs与其他免疫信号是否也有一定的关联；又是如何影响下游信号转导，以上问题都需要进一步的研究探索。