肝硬化患者血型和病情分级与VWF、FVIII和 ADAMTS13 因子的关系

潘优敏 郭仁勇 陈瑜

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院输血科（潘优敏），检验科（郭仁勇、陈瑜）

肝硬化患者血液系统中促凝和抗凝因子的失衡引起局部或全身系统的微循环障碍[1-2]。凝血系统成分的变化影响肝硬化患者肝脏损伤的严重程度，从而导致了并发症的发生，如门静脉血栓或腹水等[3]。血管性血友病因子（VWF）是内皮细胞和巨核细胞合成的多聚体糖蛋白，可介导血小板黏附于皮下胶原蛋白直接导致静脉血栓的形成。VWF是血浆VⅢ因子（F VⅢ）的载体，间接保护FVⅢ不受蛋白水解酶的降解。血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）主要表达于肝脏的星状细胞，是降解VWF结构的一种金属蛋白酶[4]。

ABO血型系统已被认为是VWF的主要决定性因素之一，VWF蛋白中存在类似于A和B血型抗原的低聚糖[5]。A和B等位基因编码的糖基转移酶可通过H抗原抑制ADAMTS 13酶对血浆VWF的水解作用。O血型人群缺乏糖基转移酶，其血浆VWF水解率明显高于非O血型人群，导致其血浆中VWF水平明显降低。本研究通过检测不同血型肝硬化患者中VWF抗原（VWF:Ag）、F VⅢ活性（F VⅢ:Ac）及 ADAMTS13抗原（ADAMTS13:Ag）的水平，探讨肝硬化患者血型和病情分级与3种因子的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2016年5月至2017年4月在浙江大学医学院附属第一医院治疗的228例肝硬化患者（肝硬化患者组），其中男 152例，女 76例，年龄 30～60（54.9±5.5岁）。肝硬化诊断标准根据全国性病毒性肝炎的预防和诊疗计划[6]。入选标准：入院前3个月内未作任何肝脏疾病治疗。根据本研究设计要求，排除标准：存在高血压、肝细胞癌、糖尿病、凝血障碍、败血症、心血管疾病、抗凝或皮质类固醇使用、肾移植、艾滋病毒感染和怀孕的肝硬化患者。健康对照组为同期本院正常体检人群168 例，其中男 106 例，女 62 例，年龄 30～60（54.0±9.5岁）。两组对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究符合人体试验伦理学的标准并得到本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 标本收集与检测 入院后第1天清晨采集患者静脉血样送检。使用含柠檬酸三钠的试管在1 500r/min、4℃条件下离心10min分离出血浆，采用酶联免疫吸附试验（试剂盒由美国R&D公司提供）检测VWF:Ag和ADAMTS13:Ag，使用德国Siemens公司试剂盒在Sysmex CA7000全自动凝血分析仪上（日本Sysmex公司）检测F VⅢ:Ac、纤维蛋白原（Fib）及D-二聚体的水平；含有乙二胺四乙酸（2.4mg/2ml静脉血样）的试管收集的血样标本采用抗A抗B血型定型试剂（中国上海血液生物医药有限公司）以间接方法检测ABO血型的表现型，使用pocH-80i血液分析仪（日本Sysmex公司）检测PLT；无任何抗凝剂试管的血样标本在3 000r/min、4℃条件下离心10min立即分离出血清，使用德国Roche公司专用试剂在日立7600自动生化分析仪（日本Hitachi公司）检测ALT、AST和TB水平。健康对照组人群均在清晨采集静脉血标本后按上述方法收集及检测。

1.3 观察项目 比较两组研究对象的性别、年龄和上述检测项目所得结果等临床参数；O血型与非O血型亚组进行比较；根据Child-Turcotte-Pugh（CTP）和终末期肝病模型（MELD）的等级评分，对不同疾病程度肝硬化患者O血型与非O血型亚组间VWF:Ag、F VIII:Ac、ADAMTS13:Ag水平进行比较。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，正态分布的计量资料采用表示，两组样本临床参数计量资料的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象的临床参数比较 见表1。

表1 两组研究对象的临床基本信息和分布特征比较

由表1可见，与健康对照组比较，肝硬化患者组血浆VWF:Ag和FVⅢ:Ac水平明显升高，而ADAMTS13:Ag水平则明显降低,差异均有统计学意义（均P＜0.01）；肝硬化患者BMI指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；O血型和非O血型比例也存在统计学差异（P＜0.05）。

2.2 两组O血型与非O血型亚组间临床参数的比较 见表2。

由表2可见，与O血型肝硬化患者相比，非O血型患者血浆中 ALT、AST、TB、D-dimmer的水平及 VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平有显著的升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而Fib及PLT水平则明显的降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与O血型健康对照组相比，非O血型健康对照组的ALT、AST、TB、D-二聚体的水平无明显变化，差异无统计学意义（均P＞0.05），而VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两组ADAMTS13:Ag水平在O血型与非O血型之间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 两组O血型与非O血型亚组间临床参数的比较

2.3 不同疾病程度肝硬化患者O血型与非O血型组间 VWF:Ag、F VⅢ:Ac、ADAMTS13:Ag的比较 根据CTP和MELD的评分等级，肝硬化患者组分别被分为亚组 Child A、Child B 和 Child C 及 Meld 1（≤7）和 Meld 2（＞7）[7]。与 Child A 肝硬化患者相比，Child C 肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Meld 1肝硬化患者相比，Meld 2肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。此外，在CTP和MELD评分的亚组分析中，O血型与非O血型肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平也存在相似的结果（均P＜0.05）。而无论CTP和MELD评分，ADAMTS13:Ag水平在O血型与非O血型肝硬化患者间无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），见图 1、2。

3 讨论

Hulstein等[8]和Stepanian等[9]报道在溶血、肝酶升高、血小板减少（HELLP）综合征或子痫前期的孕妇中不同程度的内皮细胞急性激活后释放异常庞大的VWF多聚体，在血浆中被ADAMTS13酶在A2域分解成小的VWF多聚体，从而引起VWF水平的增高和ADAMTS13水平的降低。我们的结果显示，与健康对照组相比，肝硬化患者肝脏内皮细胞的损伤引起VWF:Ag与F VⅢ:Ac水平的升高和ADAMTS13:Ag水平的降低（表1）。在血浆ADAMTS13缺乏的情况下，累积的VWF的多聚体表现出更加生物的活性，在高剪切应力的条件下诱导血小板聚集微血栓形成，从而促进了静脉微循环的障碍[10]。而肝硬化患者ADAMTS13:Ag的降低可能是由于其被升高VWF:Ag水平的降解及肝脏星状细胞释放ADAMTS13:Ag水平的减少；患者F VIII:Ac水平的升高可能是由于VWF作为FVIII因子的载体，保护了F VIII不受蛋白水解酶的降解[11]。

图1 根据C T P评分等级的分组，肝硬化患者F VⅢ:A c（a）、V W F:Ag（b）及 ADA M T S13:Ag（c）在 O 血型与非 O 血型组间的比较

图2 根据M ELD评分等级的分组，肝硬化患者F V III:A c（a）、V W F:Ag（b）及ADA M T S13:Ag（c）在O血型与非O血型组间的比较

Danyelle等[12]提出非O血型的血液透析患者血浆VWF:Ag被ADAMTS13酶分解的速率明显低于O血型患者VWF:Ag的分解速率。因此，非O血型的患者具有相对较高的VWF:Ag和F VIII:Ac水平，导致血栓栓塞的风险增大。本研究显示非O血型肝硬化患者存在显著升高的VWF:Ag水平和 F VIII:Ac（表2），甚至在CTP和MELD评分亚组分析中存在相似的结果。可能是由于非O血型肝硬化患者肝脏内皮细胞的损伤释放大量的VWF多聚体；也可能是因为血浆VWF的N-联寡糖和a2-巨球蛋白表达ABO血型抗原，而VWF的A、B抗原结构以共价键与VWF的N-联寡糖相结合，保护VWF免受ADAMTS13酶的降解，从而引起明显升高的VWF水平[13]。相反，O血型肝硬化患者因缺乏A、B抗原而表现出相对低水平的VWF:Ag。因此相对于O血型肝硬化患者，非O血型的患者存在更高水平的VWF:Ag，从而促进了患者静脉微循环障碍或高凝状态的形成。

然而，ADAMTS13:Ag在O血型与非O血型肝硬化患者间不存在明显的差异，可能是因为肝硬化患者肝脏星状细胞释放少量的ADAMTS13，其水平的变化超过或掩盖了ABO血型对ADAMTS13的影响。健康对照组人群中ADAMTS13:Ag水平在O血型与非O血型间的比较也无统计学意义，可能是由于标本数量的局限性导致VWF和ADAMTS13平衡的代偿机制没有发挥重要的意义。

CTP和MELD的评分已经广泛用于评估肝硬化患者肝脏疾病的严重程度[7]。随着肝脏疾病损伤严重程度的增加，VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平均存在递增的趋势（图1、2），而且O血型或非O血型的患者分别存在相似的递增趋势。在CTP和MELD评分的亚组中非O血型患者VWF:Ag水平及F VⅢ:Ac明显高于O血型患者的水平，表明非O血型患者的肝脏损伤比O血型患者更加的严重，易引起微循环障碍而导致静脉血栓等并发症的发生。以往文献报道[14-15]血浆中ALT、AST、TB与肝脏疾病的严重程度呈正相关，而D-二聚体和Fib呈负相关，且非O血型肝硬化患者存在升高的ALT、AST、TB和D-二聚体及降低的Fib和 PLT（表 2）。从而更进一步证实了非O血型肝硬化患者肝脏损伤程度较O血型患者更加的严重。

综上所述，非O血型肝硬化患者存在升高的VWF:Ag水平和F VⅢ:Ac，且易形成静脉微循环障碍状态，其病情的发展较O血型患者更加的严重，并可诱发相关肝硬化并发症，如静脉血栓等。因此，为了降低非O血型肝硬化患者病情进一步发展的风险，建议患者定期的门诊随访而采取一些有效的防治措施。