α-红没药醇对胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭的影响

2018-09-07闫海斌徐如祥解放军总医院北京100853陆军总医院附属八一脑科医院北京10008

解放军医学院学报 2018年8期

闫海斌，徐如祥解放军总医院，北京 100853；陆军总医院附属八一脑科医院，北京 10008

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，具有发病率高、生长迅速、复发率高、预后差、死亡率高等特点[1]，尤其是胶质母细胞瘤，恶性程度高，呈侵袭性生长，手术难以彻底切除，综合现有的手术及放化疗手段，中位生存期仅为1年[2]。胶质瘤的发生、发展与多种癌基因相关。近年研究发现多种酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases，RTKs)基因的过表达在胶质瘤发生发展中具有重要作用，c-Met基因是其中重要的一个[3-5]。c-Met是一种由c-Met原癌基因编码的肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，参与广泛的细胞信号传导，涉及细胞增殖、运动、迁移和侵袭等。c-Met信号失调是许多恶性肿瘤的驱动因素，并促进肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成[6]。李宏武和单吉[7]研究发现c-Met在大肠癌中显著过表达并参与肝转移，蔡博文等[8]发现c-Met表达水平与人脑胶质瘤恶性表型及侵袭性密切相关。以c-Met作为靶点成为治疗胶质瘤的重要途径之一[9-13]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是降解细胞外基质的重要酶类，在划痕愈合、骨吸收和血管生成等生理活动和信号传递过程中起重要作用。MMPs在许多肿瘤中过度表达，与肿瘤的迁移和侵袭密切相关[14-18]。MMP-2、MMP-9都属于MMPs家族中的明胶酶，能降解明胶、Ⅳ型胶原等细胞外基质，在肿瘤的迁移和侵袭中起重要作用[14]。有文献报道，c-Met可调节MMPs表达，从而影响肿瘤的迁移和侵袭[19-21]。α-红没药醇(α-Bisabolol)是一种脂溶性倍半萜类化合物，广泛存在于洋甘菊、春黄菊等植物精油中[22-23]。前期研究显示其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗寄生虫等作用，对多种肿瘤细胞也具有抑制作用。Seki等[24]和Darra等[25]研究发现α-红没药醇能诱导胰腺癌细胞凋亡，Chen等[26]研究发现α-红没药醇能诱导人肝癌细胞凋亡，Cavalieri等[27]研究发现α-红没药醇能诱导人脑胶质母细胞瘤细胞凋亡。α-红没药醇可调节Fas、P53、NF-кB、P13K/Akt等多种信号通路，引起肿瘤细胞凋亡等生物学效应，但其是否通过调节c-Met影响胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭尚未见报道。本实验通过研究α-红没药醇对胶质母细胞瘤细胞U251、U87迁移和侵袭的作用及其分子机制，为临床胶质母细胞瘤的治疗提供一种新的思路。

材料和方法

1 主要试剂 α-红没药醇(纯度≥95%，美国Sigma公司)，DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，青、链双抗(美国Hyclone公司)，CCK8检测试剂盒(日本同仁化学研究所)，8μm孔径Transwell小室(美国Corning公司)，Matrigel胶(美国Corning公司)，结晶紫(北京雷根生物科技有限公司)，兔抗人c-Met多克隆抗体、兔抗人MMP-2多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)、兔抗人MMP-9多克隆抗体(美国Abcam公司)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(北京中杉金桥生物科技有限公司)，山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物科技有限公司)，c-Met过表达质粒及空载质粒(南京巴奥得生物科技有限公司)，无内毒素质粒大提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，Lipofectamine 3000转染试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

2 细胞培养人脑胶质母细胞瘤细胞U251、U87购自协和医学院基础医学研究所细胞中心。细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱中，0.25%胰蛋白酶常规消化传代，每2 ～ 3 d传代1次。α-红没药醇用无水乙醇配置为1 mmol/L的母液，储存于-20℃，使用时用新鲜培养基稀释为工作浓度。由于α-红没药醇不溶于水，溶液中有效溶解浓度仅为加入药物总量的2.5%[27]，如无特殊说明，后面实验中所指浓度均为有效溶解浓度。

3 细胞增殖实验取对数生长期细胞常规消化后计数，用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬为4×104/ml，接种入96孔板。实验分6组，每组设3个平行孔，1 ～ 5组每孔100μl细胞悬液，6组只加入培养基，边缘孔用无菌PBS填充。培养8 h，待细胞完全贴壁后，小心吸去培养基，1 ～ 5组分别加入含0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/Lα-红没药醇的培养基，放培养箱中继续培养24 h，每孔加入CCK8试剂10μl，再培养1 ～ 4 h，多功能酶标仪于450 nm处测吸光度值(OD值)，以0μmol/L组为阴性对照，以只含培养基组为空白对照，计算各组细胞存活率。公式：细胞存活率=(OD实验组-OD空白对照组)/(OD阴性对照组-OD空白对照组)×100%。

4 细胞划痕实验实验分3组，每组3个平行孔。取对数生长期细胞常规消化后计数，重悬为4×105/ml，接种入6孔板，每孔2 ml。待细胞处于对数期且贴壁约90%时，用20μl枪头在培养皿底部中线附近划2条平行直线，尽量保持划痕均匀。无菌PBS洗涤3次，去掉脱落及未贴牢细胞。按分组分别加入含0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇的1%胎牛血清培养基，放高倍镜下拍照，作为原始对照。继续培养24 h后，高倍镜下观察拍照。划痕愈合百分比=(1-24 h划痕面积/0 h划痕面积)×100%。

5 Transwell小室侵袭实验每个Transwell小室加入100μl Matrigel胶。取对数生长期细胞，常规消化计数后用含1%胎牛血清DMEM高糖培养基重悬为5×104/ml。实验分3组，每组3个平行孔。上室加入200μl细胞悬液，下室按分组加入600μl含不同浓度α-红没药醇(0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L)的20%胎牛血清DMEM高糖培养基。37℃细胞培养箱培养24 h后，用棉签小心擦去上室细胞及基质胶，室温下甲醇固定10 min，倒置风干，0.1%结晶紫溶液染色30 min后PBS冲洗，倒置风干后，每个小室随机选取3个视野拍照并计数穿梭到下室的细胞。

6 Western blotting检测蛋白表达取对数生长期U87、U251细胞，常规消化传代后，接种于培养皿中，8 h后吸去培养基，加入含0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇的10%胎牛血清DMEM高糖培养基，37℃培养箱中培养24 h。裂解细胞提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，根据测定浓度每孔上样40μg，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。按照待测分子量切取凝胶，280 mA，70 min转到PVDF膜上。5% BSA(1×TBST稀释)封闭1 h后放入杂交袋中，加入相应兔抗人c-Met、MMP-2、MMP-9，鼠抗人GAPDH一抗，4℃孵育过夜。1×TBST洗膜3次，每次5 min。分别加入山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗，室温孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min。滴加ECL化学发光试剂，于凝胶成像系统曝光成像。用Image lab分析条带灰度值。

7 细胞转染实验将U251细胞分为空载质粒组(A组)、空载质粒加药组(B组)，c-Met过表达组(C组)、c-Met过表达加药组(D组)。常规消化计数U251细胞，重悬为1×105/ml，接种于6孔板，每孔2 ml，培养24 h后Lipofectamine 3000转染细胞。A、B组转染空载质粒，C、D组转染c-Met过表达质粒，转染后24 h，A、C组换新鲜培养基，B、D组加入2.5μmol/Lα-红没药醇。划痕实验检验细胞迁移能力，Transwell实验检验细胞侵袭能力，Western blotting检测相关蛋白表达变化，方法同上。

8 统计与分析每组实验重复3次以上，所有数据均采用SPSS23.0统计软件进行分析。计量资料以-x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 α-红没药醇对U251、U87细胞增殖的影响0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L组U251细胞存活率分别为100%±0.00%、96.89±7.30%、61.22%±5.08%、29.48%±4.84%，U87细胞存活率分别为100%±0.00%、97.86%±5.41%、95.31%±5.42%、55.72%±8.17%、19.66%±4.82%。0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L组细胞存活率差异无统计学意义，随浓度升高5μmol/L及10μmol/L组细胞存活率呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义(U251：F=322.938，P=0.00；U87：F=331.451，P=0.00)。见图 1。

图1 CCK8比色法检测不同浓度α-红没药醇对U87、U251增殖的影响(aP＜0.05, vs 0 ～ 2.5 μmol/L)Fig. 1 Effects of different concentrations of α-bisabolol on proliferation of U251 and U87 cells (aP＜0.05, vs 0-2.5 μmol/L)

2 α-红没药醇对U251、U87细胞迁移的影响0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇作用于U251细胞24 h后，划痕愈合百分比分别为49.36%±5.44%、35.08%±3.79%、23.89%±4.51%，各组间差异有统计学意义，且随药物浓度增加细胞存活率逐渐下降。0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L α-红没药醇作用于U87细胞24 h后，划痕愈合百分比分别为46.64%±4.83%、33.42%±3.10%、22.35%±3.62%，各组间差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随药物浓度增加细胞存活率逐渐下降。见图2。

3 α-红没药醇对U251、U87细胞侵袭的影响0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇作用于U251细胞24 h后，Transwell穿梭到下室的细胞数分别为248.67±14.94、171.11±17.91、87.11±15.49，各组间两两相比，差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随药物浓度增加，穿梭到下室的细胞数逐渐下降。0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇作用于U87细胞24 h后，Transwell穿梭到下室的细胞数分别为202.44±16.98、145.44±11.91、71.98±9.32，各组间两两相比，差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随药物浓度增加，穿梭到下室的细胞数逐渐下降。见图3。

4 α-红没药醇对U251、U87细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响 0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L α-红没药醇作用于U251细胞24 h后，以GAPDH为内参，以0μmol/L组为对照，MMP-2表达量分别为 1.00±0.00、0.70±0.08、0.32±0.10，MMP-9表达量分别为 1.00±0.00、0.69±0.09、0.24±0.07。各组间两两相比差异有统计学意义(P＜0.05)，且随药物浓度增加，两种蛋白表达量都逐渐下降。0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L α-红没药醇作用于U87细胞24 h后，MMP-2表达量分别为 1.00±0.00、0.71±0.10、0.29±0.04，MMP-9表达量分别为 1.00±0.00、0.72±0.08、0.23±0.04。各组间两两相比差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随药物浓度增加，两种蛋白表达量都逐渐下降。见图4。

5 α-红没药醇对U251、U87细胞c-Met蛋白表达的影响 0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇作用于U251细胞24 h后，以GAPDH为内参，以0μmol/L组为对照，c-Met表达量分别为1.00±0.00、0.70±0.09、0.33±0.08，各组间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随浓度升高，c-Met表达量逐渐下降。0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/Lα-红没药醇作用于U87细胞24 h后，c-Met表达量分别为1.00±0.00、0.71±0.08、0.27±0.08，各组间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随浓度升高，c-Met表达量逐渐下降。见图5。

6 转染c-Met过表达质粒后部分逆转α-红没药醇对U251细胞迁移的抑制作用空载质粒组(A组)、空载质粒+2.5μmol/Lα-红没药醇组(B组)、c-Met过表达质粒组(C组)、c-Met过表达质粒+2.5μmol/Lα-红没药醇组(D组)划痕愈合百分比分别为48.07%±4.13%、13.11%±2.99%、65.45%±5.25%、35.61%±4.70%。各组之间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，且D组较B组划痕愈合百分率明显升高。提示过表达c-Met后部分逆转了α-红没药醇对胶质母细胞瘤迁移的抑制作用。见图6。

7 转染c-Met过表达质粒后部分逆转α-红没药醇对U251细胞侵袭的抑制作用空载质粒组(A组)、空载质粒+2.5μmol/Lα-红没药醇组(B组)、c-Met过表达质粒组(C组)、c-Met过表达质粒+2.5μmol/Lα-红没药醇组(D组)穿梭到下室的细胞数分别为254.33±15.72、91.33±14.46、367.00±25.78、209.44±18.13。各组之间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，且D组较B组穿梭到下室的细胞数明显增加。提示过表达c-Met后逆转了α-红没药醇对胶质母细胞瘤侵袭的抑制作用。见图7。

8 转染c-Met过表达质粒后部分逆转α-红没药醇对U251细胞MMP-2和MMP-9表达的抑制作用 Western blotting检测c-Met、MMP-2、MMP-9表达量的变化，以GAPDH为内参，以空载质粒组(A组)为对照，空载质粒+2.5μmol/Lα-红没药醇组(B组)、c-Met过表达质粒组(C组)、c-Met过表达质粒+2.5μmol/Lα-红没醇组(D组)，c-Met表达量分别为 100.00±0.00、0.39±0.04、1.56±0.06、0.60±0.04，各组间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。MMP-2表达量分别为1.00±0.00、0.49±0.08、1.46±0.12、0.71±0.10，各组间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。MMP-9表达量分别为 1.00±0.00、0.45±0.07、1.41±0.11、0.73±0.11，各组间两两比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。D组各蛋白表达量较B组均显著升高，提示过表达c-Met后，逆转了α-红没药醇对c-Met的抑制作用，进而部分逆转了α-红没药醇对MMP-2及MMP-9的抑制作用。见图8。

图2 细胞划痕实验显示α-红没药醇对U251、 U87细胞迁移的影响(×400) (aP＜0.05, vs 0μmol/L)Fig. 2 Cell scratch test shows the effects of 0 µmol/L, 1.25 µmol/L, 2.5 µmol/L of α-bisabolol on migration of U251 and U87 cells (×400) (aP＜0.05, vs 0μmol/L)

图3 不同浓度α-红没药醇对U251、U87细胞侵袭能力的影响(×400) (aP＜0.05, vs 0μmol/L)Fig. 3 Effects of 0 µmol/L, 1.25 µmol/L, 2.5 µmol/L of α-bisabolol on the invasive ability of U251 and U87 cells (×400) (aP＜0.05, vs 0μmol/L)

图4 不同浓度α-红没药醇作用于U251、U87细胞24 h后Western blotting检测MMP-2、MMP-9表达量的变化 (aP＜0.05, vs 0μmol/L)Fig. 4 After being treated with 0 µmol/L, 1.25 µmol/L, 2.5 µmol/L α-bisabolol, western blotting was used to detect the expression level of MMP-2, MMP-9 protein in U251 and U87 cells (aP＜0.05, vs 0μmol/L)

讨论

本实验首先用CCK8比色法检测了α-红没药醇对胶质母细胞瘤细胞U251、U87的增殖抑制作用，探索药物作用的合适浓度。通过细胞划痕实验、Transwell实验发现了α-红没药醇对U251、U87细胞迁移和侵袭的抑制作用，Western blotting检测发现与肿瘤迁移和侵袭密切相关的金属基质蛋白酶MMP-2及MMP-9表达下调，同时我们发现α-红没药醇也引起了c-Met表达的下调，于是建立了c-Met是MMP-2、MMP-9的上游调节蛋白的假设。为进一步验证猜想，我们在U251细胞中转染了过表达c-Met的质粒，继续用α-红没药醇作用于肿瘤细胞，通过细胞划痕实验、Transwell实验发现过表达c-Met后部分逆转了α-红没药醇对U251细胞迁移和侵袭的抑制作用。Western blotting检测发现，过表达c-Met后MMP-2、MMP-9的表达也同时上调，进一步证实了我们的假设。由此我们得出α-红没药醇通过下调c-Met进而抑制胶质母细胞瘤迁移和侵袭的结论。

胶质母细胞瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，由于其侵袭性生长的特性，侵犯周围血管神经，导致手术难以切除干净，原位复发率高，预后极差，严重威胁患者生命健康，是神经外科重要的一类疾病。且由于血脑屏障的存在，普通化疗药物难以通过，不能在肿瘤局部达到有效作用浓度，普通化疗药物的应用受到极大限制，目前推荐的一线化疗药物仅有替莫唑胺等少数药物[28]。因此找到一种既能顺利透过血脑屏障又能高效杀灭胶质母细胞瘤细胞的药物成为临床治疗的焦点和难点。随着科学研究的深入，我们发现植物中存在很多天然生物活性分子，从中筛选有效的抗肿瘤药物成为目前重要的研究方向。

α-红没药醇是来自洋甘菊、春黄菊等植物头状花序精油中的脂溶性生物活性分子，应用于化妆品行业已经有上百年历史，具有良好的皮肤穿透性。既往研究表明，α-红没药醇能诱导多种肿瘤细胞凋亡[24,26,29-31]，对体外胶质母细胞瘤细胞也具有高效杀灭作用，而同样浓度下对正常组织细胞几乎没有影响。但α-红没药醇对胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭作用的影响却鲜有报道。本实验通过研究发现，α-红没药醇不仅能有效抑制胶质母细胞瘤细胞U251、U87增殖，还能通过阻断c-Met，进而下调金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。