OAS1基因多态性与脊柱结核的关联性分析

张 庭，史晨辉，高立华

(1. 南方医科大学附属南海医院，广东佛山 528200； 2. 石河子大学医学院第一附属医院骨科中心，新疆石河子 832002)

结核病是一种常见的慢性感染性疾病。每年有数以百万计的人被诊断为结核病，2015年，结核病成为全球10大导致死亡的疾病之一。致死率高于HIV，是目前主要导致死亡的感染性疾病。我国在结核病控制方面取得很大成绩，但仍然是结核病的高负担国家。每年新发结核患者约90万，位居全球第3位[1]。据报道，全世界有1/3的人感染结核分枝杆菌，2～3亿(5%～15%)潜伏结核感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)在其一生中会进展为结核病[2]。这些患者为何会进展为结核病，目前尚未完全研究清楚。

结核病发病一般认为与环境、基因相关。既往研究通过双胞胎、候选基因关联研究、全基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)发现结核病与患者基因相关联[3-5]。随着近年来多耐药结核和HIV患病率的上升，脊柱结核的发生率在持续升高[6]。脊柱结核常常累及椎体和椎间盘，并且会导致脊柱不稳定、脊柱后突畸形、压缩性骨折和神经损伤。寡腺苷酸合成酶1(OAS1)作为OAS家族中的一员，被双链RNA激活并且促进寡聚化ATP酶转化成2′-5′寡聚腺苷酸(2-5A)。OAS属于干扰素(interferon, IFN)诱导酶，由IFN诱导产生[7]，而IFN在人体清除结核分枝杆菌的过程中发挥重要作用[8]。OAS1基因位于12号染色体，在人体固有免疫对抗病毒感染的过程中发挥重要作用。

研究发现，OAS1基因多态性与多种疾病相关[9-10]。目前尚无研究报道OAS1基因多态性与脊柱结核发病的关系。本研究将探讨OAS1基因rs1131454和rs10774671位点多态性与脊柱结核的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象实验组脊柱结核患者113名来自石河子大学医学院第一附属医院骨科，114名健康对照组来自石河子大学医学院第一附属医院体检中心。实验组和对照组参与者均无血缘关系。脊柱结核通过影像学检查、血清学检查、术后病灶组织病理切片、脓液抗酸染色及分离培养结核分枝杆菌确诊。实验组和对照组的排除标准：合并肿瘤、HIV阳性、免疫疾病、肝病和其他慢性疾病。所有纳入对象均签署知情同意书，同时记录基本信息。

1.2DNA提取和基因分型每位参与者抽取5 mL静脉血，储存在EDTA抗凝管中并存放在-20 ℃冰箱中。用DNA提取试剂盒(Axygen Scientific公司生产)从全血中提取DNA，然后存放在-20 ℃冰箱中直到基因分型。本研究基因分型方法采用多重高温连接酶检测反应技术(iMLDR)和聚合酶链反应(PCR)。测序由上海天昊遗传分析中心完成。

1.3tagSNP的选择方法tagSNP是一种代表性的SNP，位于高度连锁不平衡的基因组区域，能够代表周围高度连锁的多个SNP。研究tagSNP与表型的关系能够提高研究效率，不需要将所有的基因组序列进行分型。所有IFNG和IFNGR1基因SNP位点都从HapMap网站下载(http://www.hapmap.org/)，选取的数据是北京汉族人群。在下载tagSNP时选择条件设置为上游延伸2 000碱基对，下游延伸2 000碱基对。所有纳入的SNP筛选标准：①符合哈温平衡定律(Hardy Weinberg Equilibrium, HWE)；②连锁不平衡值r2≤0.8；③最小等位基因频率≥0.05。tagSNP的筛选过程全部由在线软件(http://gvs.gs.washington.edu/GVS144/)完成。

1.4统计学方法所有统计分析皆用SPSS 19.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)统计软件。采用卡方检验分析HWE和两组性别、抽烟情况是否均衡可比；非配对t检验分析两组年龄是否有差异；使用Logistic回归计算优势比(OR)和95%可信区间(95%CI)；计量资料以(均值±标准差) 表示；连锁不平衡和单倍体分析采用在线软件进行分析(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)。连锁不平衡分析采用r2进行评估(r2<0.5)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1研究对象的基本信息年龄、性别、吸烟情况在两组间差异均无统计学意义(表1)。

表1实验组和对照组基本信息

Tab.1 The basic characteristics of the experimental group and control group

特征实验组(n=113)对照组(n=114)P年龄(岁, x±s)39.35±17.1237.84±17.110.509男性[n(%)]66(58.4)68(59.6)0.893抽烟[n(%)]33(29.2)41(36.0)0.322

2.2基因多态性与脊柱结核的相关性所有纳入基因位点符合HWE，表2为两组基因型和基因频率分布。两组中等位基因模型没有统计学差异。

表2OAS1基因在实验组和对照组中的基因型分布

Tab.2 Association between OAS1 genotypic/allelic frequencies and spinal tuberculosis

SNP基因型实验组频数(%)对照组频数(%)POR95% CIrs1131454AA90(80)75(67)参照AG22(20)33(29)0.0030.5320.354～0.801GG 0(0) 4(4)0.0080.7880.660～0.940A202(52)183(48)参照G22(35)41(65)0.1401.0070.998～1.017rs10774671AA78(69)84(74)参照AG32(28)27(24)0.4441.2690.690～2.332GG 3(3) 3(3)0.9510.9480.177～5.068A188(49)195(51)参照G38(54)33(46)0.5361.1770.703～1.970

在rs1131454基因位点中，与AA基因型比，AG为脊柱结核保护因素(OR=0.532，95%CI：0.354～0.801，P=0.003)。同时，GG与AA相比较也是脊柱结核保护因素(OR=0.788，95%CI：0.660～0.940，P=0.008)。

2.3单倍体分析和连锁不平衡分析本研究中rs1131454和rs10774671无连锁关系(r2<0.5，图1)。单倍体分析结果提示，GC单倍体是脊柱结核的保护因素(OR=0.49，95%CI：0.28～0.86，P=0.010)。

表3实验组和对照组的单倍体分析

Tab.3 Haplotypes of the OAS1 genes and their distributions in the patients and controls

单倍体实验组频数(%)对照组频数(%)POR(95% CI)AC31(14)27(12)0.5491.18(0.68～2.06)AG169(76)156(70)0.1241.39(0.91～2.12)GC22(10)41(18)0.0100.49(0.28～0.86)

图12个SNP的连锁不平衡分析

Fig.1 Linkage disequilibrium r2values for the two SNPs

3 讨 论

本研究首次探讨了OAS1基因rs1131454和rs10774671位点多态性与脊柱结核的关系，发现了rs1131454 AG、GG基因型是脊柱结核的保护因素。同时发现GC单倍体与脊柱结核相关，也是它的保护因素。结核病的发生发展受多种因素影响，包括病原体、宿主自身免疫状况、环境等因素，基因多态性在结核病的发生发展中起重要作用[11]。研究结果证明，OAS1基因多态性与脊柱结核的发病是相关的。

在结核病的发生发展中，IFN α/β起重要作用[12]。当机体在抵抗外来病原体时，IFN-α、IFN-β和IFN-γ在机体免疫反应中作用重大，其中IFN-γ在控制细胞内结核菌感染起重要作用，它通过激活吞噬细胞、单核细胞核Th1细胞更好的清除结核菌[13]。而IFN能够诱导OAS酶的合成，OAS酶在固有免疫和抗病毒过程中发挥重要作用。OAS1作为OAS家族中的一员，可通过IFN结合到特应性抗体引起OAS1酶的激活[14]，促进2-5A的合成，和潜在RNA酶L结合，进而转变成激活状态。这种激活状态在细胞凋亡、分化和蛋白合成中起重要作用。我们研究假设的提出是基于OAS1与IFN-γ紧密联系从而影响结核病的发生发展。

研究表明，OAS1基因多态性通过影响基因表达、酶活性等影响OAS1蛋白的功能。国内外基因多态性关联研究证明了OAS1基因多态性与多种疾病的发生、发展是相关的。目前关于OAS1研究最多的是其与病毒之间的关联性研究，比如西尼罗病毒、肝炎病毒、屈曲病毒、麻疹病毒等等，这些病毒侵入机体引起机体发病都被证明与OAS1的基因多态性有关。同时，也有文献报道，1型糖尿病、自身免疫性疾病也与OAS1基因多态性相关。目前尚无研究证实OAS1基因多态性与脊柱结核的关系。本研究结果显示，OAS1基因多态性与脊柱结核发病的关联具有统计学意义。首先，OAS蛋白的主要作用是参与固有免疫，已有报道证实OAS蛋白在细胞功能中发挥重要作用。有研究报道OAS1在免疫相关疾病的发生发展中发挥重要作用，在结核的感染、进展过程中，机体免疫反应参与结核杆菌的清除。其次，OAS1基因可能通过Ⅱ型IFN通路影响脊柱结核的发生发展，IFN-γ在机体抵抗细菌入侵时发挥重要作用，可以通过激活巨噬细胞进而抑制结核杆菌的生长、繁殖。NOGUCHI等[15]证明OAS1基因多态性与呼吸道感染是相关联。

rs1131454作为一个功能性位点，位于进化保守3号外显子区域，其特点是非同义替换(G→A等位基因的突变导致G→S氨基酸的改变)。rs1131454位点位于OAS1异构体的dsRNA结合部位附近，3种基因型AA、AG和GG可分别导致OAS1酶出现低、中度、高度3种活性[16]。在本研究中发现了杂合子模型和纯合子模型与脊柱结核相关联，AG和GG基因型与脊柱结核相关联，这一点与上述酶活性相一致。rs1131454在以前的报道中被证实与1型糖尿病和严重急性呼吸综合征相关联[17-18]。rs10774671位于OAS1基因7号外显子剪接受体，并且rs10774671能够影响OAS1基因剪接作用[9]。rs10774671是OAS1的功能性位点，也可以影响OAS酶抗病毒活性。既往研究发现，rs10774671多态性与病毒、1型糖尿病、呼吸道感染相关[9,17,19]，本研究首次发现rs10774671多态性与脊柱结核无关联。

综上所述，OAS1基因多态性位点rs1131454与脊柱结核的发生具有一定相关性，尤其是携带G等位基因的患者更可能发展成为脊柱结核。在后续的实验中，我们有必要扩大样本量、在其他民族中验证，并做一些功能性研究进一步验证结果。