加工工艺对蓝莓汁和蓝莓酒中花色苷及类黄酮的影响

刘 慧，刘杰超，吕真真，杨文博，张春岭，焦中高*

（中国农业科学院 郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

蓝莓为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniumspp.）植物，果实富含糖、酸、蛋白质、氨基酸、维生素和膳食纤维等，还含有丰富的酚类物质如花色苷、酚酸、类黄酮等，具有很强的清除自由基的作用[1-2]，具有减肥、促进视红素合成、改善糖尿病并发症、抗炎、抗心血管疾病、抗癌、抗衰老等多种生理活性功能[3-6]。被称为“浆果之王”，联合国粮农组织将其列入“人类五大健康食品之一”[7]。

由于蓝莓成熟期正值夏季，且生产时间集中，果实不易贮藏、运输，容易造成积压[8]。推动蓝莓加工产业发展是解决这些问题的主要途径，加工制品中的蓝莓汁及蓝莓酒可以较好的保留原料的营养物质，发酵过程还会产生新的风味物质及功能活性物质，成为蓝莓加工产品中的主导[9]。花色苷、类黄酮等多酚类物质是蓝莓酒中的一类重要化合物，与酒的品质密切相关，同时还与蓝莓酒的抗氧化能力呈正相关关系[10]。但加工过程极易引起蓝莓中活性物质的分解，降低其营养价值，因此选择合适的加工条件保留蓝莓果实丰富的营养物质，成为蓝莓加工领域的研究热点，对优化发酵工艺、指导蓝莓加工生产实际有着积极的推动作用[11]。然而，目前对蓝莓汁、蓝莓酒的研究多集中在以出汁率、酒精度或感官品质为评价指标的工艺优化方面，有关蓝莓加工过程中主要成分的变化情况已经有一些研究[12-13]，而对类黄酮物质的相关研究较少。该研究通过对蓝莓制汁及发酵过程中类黄酮及花色苷物质的含量分析，探讨不同加工工艺对蓝莓主要活性成分的影响，为蓝莓汁及蓝莓酒的加工提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓（品种“粉蓝”）：采自连云港市赣榆区沙河镇。

酵母：实验室保存的Ⅱ#酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），接种时细胞数2×108CFU/mL；白砂糖（食品级）：市售；果胶酶（26 000 PG/mL）、果浆酶（30 000 UPTE/mL）、α-淀粉酶（460 AGU/mL）（食品级）、纤维素酶（8 200 U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；芦丁标准品（纯度≥98%）：中国食品药品检定研究所。

1.2 仪器与设备

JYL-G12料理机：九阳股份有限公司；PAL-1迷你数显糖度计：日本ATAGO公司；LRH-250A生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；L-550离心机：湘仪离心机仪器有限公司；Jena 50紫外可见分光光度计：德国耶拿分析仪器股份公司；SHA-22水浴恒温振荡器：金坛精达仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓制汁工艺

（1）蓝莓制汁工艺流程

（2）酶解工艺参数优化

在前期试验基础上，固定酶解温度60℃、酶解2 h，酶添加量3‰，考察酶种类（不加酶、果胶酶、果浆酶、纤维素酶、淀粉酶）对蓝莓出汁率、可溶性固形物（soluble solid content，SSC）、花色苷和类黄酮含量的影响；固定果浆酶60℃酶解2 h，考察酶添加量（0、1‰、3‰、5‰）对各指标的影响；固定添加3‰果浆酶酶解2 h，考察酶解温度（40℃、50℃、60℃、70℃）对各指标的影响；固定添加3‰果浆酶，酶解温度60 ℃，考察酶解时间（0、0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h）对各指标的影响。

（3）指标测定

出汁率的测定：分别称取果浆和离心后收集的上清液的质量，出汁率计算公式如下。

可溶性固形物的测定：手持糖度计测定。

花色苷、类黄酮含量测定：参考XIAO Z B等[14]的方法，pH示差法测定花色苷含量，以矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量表示；硝酸铝比色法测定类黄酮含量，以芦丁含量表示；单位为mg/100 mL。

1.3.2 蓝莓酒发酵工艺

（1）蓝莓酒加工工艺流程

蓝莓打浆→酶解（3‰果浆酶、60℃、2h）→添加亚硫酸（50mg/L）→调整糖度→接菌→主发酵（10 d）→过滤→后发酵（18 d）→原酒

（2）发酵工艺参数优化

在前期试验基础上，固定发酵温度25℃、接菌量4%的条件，选择蓝莓原果浆（不加糖，初始SSC 14.5%），分别考察添加不同量的外源糖（0、5%、10%）对蓝莓酒花色苷和类黄酮含量的影响；固定选用蓝莓原果浆，在接菌量4%条件下，分别考察发酵温度（20℃、25℃、30℃）对蓝莓酒发酵过程中花色苷和类黄酮含量的影响；固定选用蓝莓原果浆，在发酵温度25℃条件下，考察接菌量（2%、4%、6%）对蓝莓酒花色苷和类黄酮含量的影响。

（3）取样及指标测定

在蓝莓酒发酵前期，每天取样一次，发酵后期取样间隔增大至3d、5d和8d。蓝莓酒样品经9000r/min离心10min，取上清酒液测定花色苷和类黄酮含量，测定方法同1.3.1节。

1.3.3 数据处理

试验均进行3次重复，结果利用Microsoft Excel软件进行整理，使用SPSS11.0软件进行Duncan’s新复极差法分析差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 酶解条件对蓝莓汁出汁率及SSC的影响

按照1.3.1节工艺制备蓝莓汁，分别考察了酶种类、酶解温度、酶解时间和加酶量对蓝莓出汁率及SSC的影响，结果如图1所示。

图1 酶解条件对蓝莓出汁率（A）及可溶性固形物含量（B）的影响Fig.1 Effect of enzymatic conditions on juice yield(A)and soluble solid content(B)of blueberry

果胶酶可切裂并降解果肉中果胶的复杂分子，降低果汁中的果胶物质链结构，提高果汁出汁率[15]。由图1可知，与不加酶相比，添加果胶酶、纤维素酶和果浆酶后的蓝莓出汁率和SSC均显著提高（P＜0.05）。出汁率及SSC含量在酶解温度50℃、60℃、70℃之间不存在显著性差异（P＞0.05），但均显著高于40℃处理组（P＜0.05），60℃条件下果浆酶处理组的出汁率达到最高72.50%。随着酶解时间和果浆酶添加量的增加，蓝莓汁的出汁率及SSC先升高后趋于平缓。当酶解时间为2.0 h时，蓝莓出汁率达到72.35%，SSC为14.5%，然而继续增加酶解时间至3.0 h时蓝莓的出汁率与SSC均趋于平稳，与2.0 h之间不存在显著性差异（P＞0.05）。主要原因在于酶解的前期阶段，在酶作用下蓝莓组织及细胞壁被破坏，使蓝莓的内容物快速释放，出汁率与SSC快速增加；而在酶解2.0 h后，细胞壁多糖基本已降解，细胞内容物释放完全，因此蓝莓出汁率处于一个平衡值，如继续增加酶解时间会对活性物质造成损耗，也会增加生产成本。与对照相比，添加1‰果浆酶即可显著提高蓝莓汁SSC（P＜0.05），当酶添加量＜3‰时，蓝莓汁出汁率和SSC随着酶量的增加而增加，酶添加量为3‰时，蓝莓汁SSC增长至最高值。然而继续增加酶添加量至5‰，蓝莓出汁率趋于平稳，与3‰处理组之间不具有差异性（P＞0.05），并且会导致SSC略低于3‰添加量，该结论与前人研究的结果类似[16-18]。综上所述，蓝莓汁最佳酶解工艺条件为果浆酶添加量3‰、酶解温度60℃、酶解时间2.0 h，在此条件下蓝莓出汁率为72.5%，SSC为14.5%。

2.2 酶解条件对蓝莓汁花色苷及类黄酮含量的影响

蓝莓果实中的花色苷及类黄酮含量丰富，果汁营养价值高。按照1.3.1节方法制备蓝莓汁，测定不同酶解条件下蓝莓汁的花色苷以及类黄酮含量，结果如图2所示。

图2 酶解条件对蓝莓汁花色苷含量（A）及类黄酮含量（B）的影响Fig.2 Effects of enzymatic conditions on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry juice

由图2可知，果浆酶处理组的花色苷及类黄酮含量最高，分别为242.28 mg/100 mL和404.33 mg/100 mL，显著高于对照组的156.57mg/100mL和353.96mg/100mL（P＜0.05）。酶的加入可以使细胞壁多糖解聚，破坏细胞壁结构，提高出汁率，同时释放结合态花色苷，有效提高了蓝莓果中黄酮类和花色苷的释放[19]。适当温度的热处理可以提高花色苷的溶出率，抑制果汁中花色苷降解相关酶（过氧化物酶、多酚氧化酶等）的活性，从而减缓营养成分的损失[20]。但是，酶解温度过高会对酶活性和蓝莓果汁营养成分造成损失[17]。随酶解温度的升高，花色苷含量先增加，60℃处理达到最大值250.36 mg/100 mL，当温度增加至70℃时花色苷含量下降。而60℃条件下蓝莓汁类黄酮物质含量与70℃处理组之间不存在显著性差异（P＞0.05）。与类黄酮相比，花色苷对温度更为敏感，高温处理会造成花色苷的热分解。随着酶解时间的增加，蓝莓汁中花色苷和类黄酮含量先持续增加，到2.0h时达到最大值，继续增加酶解时间花色苷含量趋于平稳，类黄酮含量下降。酶的作用促使蓝莓果肉组织和细胞壁结构破坏，增加花色苷与类黄酮物质的溶出率，酶解2.0h后这些具有生物活性的内容物已基本溶出。蓝莓汁中花色苷的含量随果浆酶添加量的增加而增大，但当添加量高于3‰后，花色苷含量的变化趋于平稳，类黄酮含量具有相同的变化趋势。这也与蓝莓汁中有效成分的溶出率有关，由于酶解的反应底物有限，酶量的增加对反应产物的影响受限。LANDBOAK等[21]发现增加酶用量并没有显著提升果汁中的花色苷含量。综上所述，蓝莓汁最佳酶解工艺条件为果浆酶添加量3‰、酶解温度60℃、酶解时间2.0h，在此条件下花色苷和类黄酮含量分别为250.36mg/100mL和408.10mg/100mL。2.3发酵工艺对蓝莓酒花色苷及类黄酮含量的影响2.3.1发酵温度对蓝莓酒花色苷及类黄酮的影响

由图3可以看出，随着发酵反应的启动，蓝莓酒液中的花色苷与类黄酮物质显著增加（P＜0.05），第2天达到峰值，之后呈现下降趋势。主发酵期间花色苷降解较快，从第2天的峰值247.34 mg/100 mL降至第8天的130.85 mg/100 mL，含量下降47.1%。在第10天过滤后，酒液中花色苷含量较为稳定。蓝莓酒中花色苷含量在发酵前期的快速下降主要是因为酵母对色素有一定的吸附作用，以及微生物产生的酶促作用的影响，而发酵后期的缓慢降低可能主要是单宁类物质和花色苷的聚合作用[22]。发酵第2天30℃发酵的蓝莓酒花色苷物质含量高于其他2个温度条件下的蓝莓酒，是因为发酵初期30℃环境下酵母生长活跃，蓝莓果肉细胞组织被迅速破坏，增加内容物质的溶出率。发酵第4天后，30℃发酵蓝莓酒花色苷含量低于20℃与25℃发酵蓝莓酒，一是因为高温条件下酵母生长速度较快，迅速进入衰亡期，不能在发酵后期将发酵液中的糖有效转化成酒精，降低蓝莓酒酒精度，蓝莓花色苷物质的溶出速度减缓；另一方面持续的高温环境可能造成花色苷物质的降解。低温条件下发酵果酒中花色苷含量显著高于高温条件下发酵的蓝莓酒（P＜0.05），这一结论与雷霁卿等[23]的报道相同。

图3 温度对蓝莓酒花色苷含量（A）及类黄酮含量（B）的影响Fig.3 Effect of temperature on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

在发酵过程中，蓝莓酒类黄酮含量整体呈上升趋势，从发酵起始的398.58 mg/100 mL增加至超过500 mg/100 mL。酵母菌在发酵时，乙醇浓度增加，因游离的黄酮类化合物更易溶于乙醇等有机溶剂中，加大了黄酮类化合物浸出率。但由于不同发酵时间乙醇浓度的上升幅度不同，造成了总黄酮变化幅度的不同。类黄酮物质较花色苷更稳定，降解速率较慢。在发酵前期，由于高温条件酵母生长较快，发酵启动迅速，蓝莓酒中乙醇含量较高，溶出的类黄酮物质较高。但是从第13天开始30℃条件下的蓝莓酒中类黄酮物质低于25℃和20℃条件组，且25℃组的类黄酮物质含量高于20℃条件组。可能因为第10天将酒过滤后，蓝莓酒中类黄酮物质的保留受温度的影响更为明显。此外，较低温度的发酵条件可能会使生产类黄酮等多酚类物质的酶体系发生上调，产生更多的多酚类物质。综上，蓝莓酒发酵最佳温度为25℃。

2.3.2 接菌量对蓝莓酒花色苷及类黄酮的影响

由图4可知，不同接菌量条件下，蓝莓酒中花色苷含量变化趋势基本一致。发酵初期蓝莓酒中花色苷含量明显增加，接菌量4%和6%的蓝莓酒中花色苷含量最高值出现在发酵的第2天，接菌量2%组花色苷含量的峰值出现在第3天。发酵第6天起，接菌量6%的蓝莓酒中花色苷含量低于其他2组。而类黄酮含量在接菌量4%蓝莓酒发酵过程中一直高于其他2个接菌量组。接菌量与发酵周期有直接关系，接菌量小，发酵初期酵母繁殖缓慢，发酵速度慢、周期延长，发酵不充分，酒精度低，花色苷和类黄酮物质溶出率低[17]。接菌量大，发酵启动速度快，但是接种量过多，发酵培养基中的营养物质多消耗在菌体细胞的生长繁殖上，有限的营养物质不能满足酵母生长代谢繁殖，酵母残体产生酵母异味，覆盖蓝莓的酒香及澄清度，从而影响果酒的口感、风味，且容易导致花色苷迅速降解，引起果酒色泽和营养价值的降低[23]。因此，蓝莓酒发酵最佳接菌量为4%。

图4 接菌量对蓝莓酒花色苷含量（A）及类黄酮含量（B）的影响Fig.4 Effect of inoculum on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

2.3.3 初始糖量对蓝莓酒花色苷及类黄酮的影响

果酒酿制过程本质上是一个微生物通过糖酵解途径将葡萄糖和果糖代谢产生乙醇的过程，因此原料的糖含量和种类直接影响果酒的酒精产量和果酒品质。初始糖度主要为酵母菌生长繁殖提供碳源，糖度过低，酵母生长代谢所需的营养得不到满足，生长代谢较慢，不能彻底发酵，产生酒精度过低；糖量过高则会抑制酵母生长及合成代谢产物能力、延长发酵时间、同时影响组织中有效成分的溶出[17]。在相同发酵条件下，分别在蓝莓果浆加入0、5%和10%的白砂糖，研究不同起始糖含量对蓝莓酒品质的影响，结果如图5所示。

由图5可知，加入外源糖的蓝莓酒中花色苷与类黄酮含量均明显低于纯蓝莓浆酿制的果酒（P＜0.05），并且10%加糖量蓝莓酒花色苷和类黄酮含量低于5%加糖量组。考虑到GB/T 32783—2016《蓝莓酒》中要求酒精度≥5%vol，本研究中蓝莓的初始糖度可满足要求，故选择发酵初期不添加外源糖制得的蓝莓酒最佳。

图5 加糖量对蓝莓酒花色苷含量（A）及类黄酮含量（B）的影响Fig.5 Effect of sugar addition on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

3 结论

以蓝莓加工主导产品蓝莓汁和蓝莓酒为研究对象，测定了不同工艺条件下蓝莓汁、蓝莓酒中花色苷、类黄酮物质的变化规律。在蓝莓果浆中加入3‰果浆酶，60℃酶解2 h，可以显著提高蓝莓汁中花色苷及类黄酮物质的含量。在蓝莓酒发酵过程中，花色苷呈现持续减少的趋势，而类黄酮含量缓中有增。发酵初期以蓝莓浆为原料（SSC14.5%），在接菌量4%、25℃进行发酵和陈酿更有利于维持蓝莓酒中花色苷和类黄酮物质含量。发酵初期添加外源糖使得花色苷物质和类黄酮物质减少，生产中可以在发酵中期补糖，选择合适的糖种类并尽量控制外源糖的添加量。