检测低浓度布鲁氏菌抗体的阻抗型免疫传感器构建
2018-09-07韩小平宋海燕张志勇冯俊惠左月明
杨 威, 韩小平, 宋海燕, 张志勇, 冯俊惠, 左月明
(山西农业大学工学院,山西太谷 080801)
布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患性传染病[1-2],该病常给农业生产带来巨大损失。传统的血清学检测技术无法对低浓度的布鲁氏菌抗体进行快速、准确的检测。因此,本研究利用电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、分析速度快、设备简单等特点,结合血清学检测方法,旨在研制能够快速、准确地检测低浓度布鲁氏菌病抗体的免疫传感器,为及早发现布病、减轻布病对农业生产和人类健康的威胁提供技术支持。
电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy,简称EIS)是电化学暂态技术,是以微小振幅的正弦波为扰动信号的电化学测量方法[3],通过记录载体表面的电容和界面的电子转移阻抗等参数的变化来分析生物分子在载体表面的固定情况,以获得更多关于体系的信息,提供评价分析生物学体系的电化学手段。例如,平倩倩构建了分子印记传感器,通过交流阻抗谱法对大肠杆菌进行特异性检测[4]。许丽等设计了检测大肠杆菌数量的电化学阻抗传感器[5]。Santos等用EIS方法构建了检测大肠杆菌的传感器[6]。由相关研究可知,电化学阻抗谱技术在免疫复合物的检测上已有很好的应用,在频率域上用电化学阻抗谱定量检测抗体可以获得更全面的信息。本试验在有氧化还原对{[Fe(CN)6]3-/4-}存在的情况下进行测试,通过表征电极界面的性质来检测抗原抗体复合物[7],构建阻抗型免疫传感器,为低浓度布鲁氏菌抗体定量检测的深入研究奠定良好基础。本试验于2014年在山西农业大学生物电子与传感器实验室完成。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
主要试验材料为由中国兽医药品监察所提供的布鲁氏菌病试管凝集试验抗原和布鲁氏菌标准阳性血清(抗体);主要试剂有罗氏公司提供的牛血清白蛋白;其他试剂有亚铁氰化钾、磷酸氢二钠、氯化钠、铁氰化钾、氯化钾、磷酸二氢钠等。所有试剂均为分析纯。
1.2 溶液配制
磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,简称PBS)的配制:称取适量磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,溶入超纯水配成 10 mmol/L 溶液后,加入0.9%氯化钠,然后将溶液的pH值调至7.4,经高温高压灭菌后,于4 ℃冰箱保存备用。
电解液的配制:将0.823 1 g铁氰化钾、1.056 1 g亚铁氰化钾和0.745 5 g氯化钾溶入PBS中,定容到100 mL,即配制成5 mmol/L支持电解液。
牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin,简称BSA):1% BSA,配制方法为将25% BSA溶于适量PBS中,使用时配制。
1.3 布鲁氏菌抗原、抗体溶液的准备
布鲁氏菌抗原用PBS稀释成浓度为4×109CFU/mL的抗原溶液。布鲁氏菌抗体按10倍梯度稀释成浓度为1×10-4~1 IU/mL的5个浓度梯度的抗体溶液。
1.4 免疫电极的制备
丝网印刷金电极用水润洗,在工作电极上滴涂10 μL抗原溶液,于37 ℃恒温、恒湿盒中放置1 h,取出后重复清洗2次。然后用牛血清白蛋白溶液封闭未反应的非特异性位点[8],于37 ℃恒温、恒湿盒中静置1 h,再充分清洗,除去未结合的牛血清白蛋白。
1.5 免疫传感器的检测方法
本试验采用同一电极依次修饰不同浓度梯度抗体的方法[9]。在电化学阻抗谱的初始电位为0.13 V、频率范围为 0.1~100 000 Hz、交流扰动信号幅值为0.005 V的条件下进行测试。测试液为电解液,全部试验在室温下进行。
1.6 数据分析
本试验数据主要用Origin 8.5软件和Zsimpwin软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 初始电位及频率范围的选择
在进行交流阻抗测试时,初始电位的选择会影响交流阻抗谱曲线的变化。本试验以丝网印刷金电极-抗原-BSA-抗体(即在丝网印刷金电极上修饰抗原,然后用BSA封闭,再绑定抗体进行测试)电极作为工作电极,通过改变参数确定合适的初始电位。分别选择 0.13、0.22 V作为考察电位。如图1所示,该曲线包括2个部分,即接近半圆的部分和直线部分,分别对应电子传递过程和扩散过程。当设置电位为0.13 V 时,曲线接近半圆的部分直径最小,接近开路电位,测试对传感器体系的影响最小,更利于反映传感器的真实性质。通常当测试频率小于0.001 Hz时,EIS为电解质的导电率,当测试频率大于100 kHz时,体系内的感抗值发生变化[10]。因此,选择初始电位为0.13 V,工作频率范围为0.1~100 000 Hz。
2.2 免疫传感器的Bode图分析
Bode图用于描述电化学体系中阻抗模的对数(lgZ)和相位角与频率对数(lgFreq)的关系。在Nyquist图中,频率值是隐含的,尤其在高频区,要标出每个点的频率比较困难,而Bode图可获得传感器体系对频率响应的相关信息,是表示EIS测试结果更有效的方法[11]。
在本研究中,当用免疫传感器测试不同浓度的抗体后,在Bode图谱中布鲁氏菌抗体的阻抗值对数随频率对数的变化规律如图2-a所示,可以看出,当lgFreq值在-1.0~1.0之间的低频段时,阻抗模的对数值随着布鲁氏菌抗体浓度由低到高变化,其值由小到大依次为1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL。如图2-b所示,当lgFreq值在 -1.0~1.0之间的低频段时,布鲁氏菌抗体的相位角随频率对数由小到大变化,按照布鲁氏菌抗体浓度值由低到高排列,该曲线能够反映免疫传感器的电阻和电容的综合特性。
阻抗的实部、虚部对数值与频率对数的关系如图3所示,可以看出,在坐标系下部,当lgFreq值为0.6~1.6时,随着频率对数的增大,阻抗的虚部对数值逐渐增大,与布鲁氏菌抗体浓度呈正比关系。在坐标系上部,当lgFreq值为-1~1时,随着频率对数值增大,阻抗的实部对数值逐渐减小,与布鲁氏菌抗体浓度呈反比关系。免疫传感器通过实部、虚部与频率对数的关系曲线,能够定性判断布鲁氏菌抗体浓度的变化规律。
2.3 免疫传感器的交流阻抗特性
在上述确定的试验条件下,将电极置于50 μL电解液中测试免疫传感器的响应。用制备的免疫传感器对浓度为1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL的布鲁氏菌抗体溶液进行电化学阻抗谱测试,当测试信号通过免疫传感器时,吸附到电极表面的免疫复合物会明显地增大电极-溶液界面的阻抗[12],出现浓差极化和电化学极化,这时电极的法拉第阻抗在高频部分为双电层的容抗弧,而在低频部分,扩散控制将超过电化学控制,出现向右上方倾斜的直线,如图4所示。当用免疫电极测试不同浓度的抗体时,电子转移阻抗明显增大,说明免疫传感器上固定的布鲁氏菌抗原与抗体发生了免疫反应,并已结合到电极表面形成免疫复合物,阻碍了氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的传递,使其难以通过电极表面获得电子。随着免疫传感器结合抗体浓度的逐步增加,电极表面的膜逐渐增厚, 图4中半圆形的直径随着布鲁氏菌抗体浓度的增大而增大。
2.4 免疫传感器的等效电路模型
试验后对测试数据通过Zsimpwin软件拟合,以此来模拟和推测电极界面所发生的物理化学过程,判断电极的表面状况。为了更好地分析本试验的电化学体系,获得电极表面动力学和扩散特征的相关参数,建立Randles模型对数据进行拟合[13]。
将免疫传感器置于含有氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-的环境中,根据电化学阻抗谱测试后的数据建立等效电路,有助于对免疫传感器系统测试结果中各组成部分作进一步探讨,利用Zsimpwin软件对电化学阻抗谱进行分析,探讨电极界面的机制。在电化学极化和浓差极化同时存在的情况下,拟合的等效电路如图5所示。可以看出,当发生极化时,由于界面浓度周期性变化产生了反映溶液中氧化还原探针扩散特性的Warburg阻抗。常相位角元件和电子转移阻抗受到电极-电解质界面的介电特性和绝缘特性影响[14]。
笔者通过Zsimpwin软件拟合每个浓度抗体测试后的阻抗数据。当抗体溶液的浓度为1×10-4~1 IU/mL时,等效电路中的Rs为(17.44+0.67)Ω,相对误差为3.85%,说明Rs不受免疫传感器表面复合物的影响。
由表1中的数据可知,免疫传感器上结合抗体后电极的电子转移阻抗发生了明显的变化。由于抗原抗体形成非导电免疫复合物,电子转移阻抗的变化值(ΔRct=Rct(Ab)-Rct(BSA))随着抗体浓度的增加而逐渐增大。拟合曲线方程为y=288.83 lgC+1 556.11,相关系数为0.972 4。
表1 抗体浓度与电子转移阻抗变化值的关系
3 结论
本试验利用电化学阻抗谱测试技术实现了布鲁氏菌抗体的定量检测。通过Zsimpwin软件对测试后的数据进行拟合,提出了免疫传感器系统的等效电路,得到该体系的4个组成部分,即电解液电阻、常相位角元件、电子转移阻抗和Warburg阻抗。在所有参数中电子转移阻抗改变量最大,当布鲁氏菌抗体溶液浓度在1×10-4~1 IU/mL范围时,Ret的变化值与布鲁氏菌抗体溶液浓度的对数值呈线性关系,相关系数为0.972 4。与其他测试方法相比,电化学阻抗谱以小振幅的正弦波信号对体系进行扰动,避免对体系产生大的影响,简化了测试数据的处理过程。