干旱胁迫下3种类型新疆野核桃保护酶和丙二醛含量的变化

余 甜， 张 萍， 陈韦多

(新疆农业大学林学与园艺学院/新疆教育厅干旱区林业生态与产业技术重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052)

世界上有1/3以上的土地处于干旱、半干旱地区，而非干旱地区在植物生长季节也常发生不同程度的干旱[1]，干旱已成为世界范围内影响农业生产的主要现象之一。目前，对植物耐旱机制的研究日益受到重视，且多集中在干旱胁迫时植物的生理生化反应及相应的适应性机制[2-3]。在长期进化过程中，植物形成保护系统以清除活性氧，减轻或避免活性氧对细胞造成的伤害，而抗氧化酶系的表达和渗透调节物质的积累提高了植物的抗逆性，最终体现为植物对干旱胁迫的抗性[4-5]。

新疆野核桃(Juqlans regia)属胡桃科、胡桃属植物，既是珍稀野生林木资源，又是世界上稀有的野生核桃资源，中国仅在新疆维吾尔自治区伊犁巩留县野核桃沟有成片分布，并经考证认为是栽培核桃的直系祖先[6-7]，按种子特征主要划分为14个类型[8]。有研究发现，影响新疆野核桃生长繁衍的限制因素主要是生境温度和湿度[9-10]。本试验以卵圆形、尖嘴形、心形3种类型新疆野核桃为研究对象，测定干旱胁迫下新疆野核桃苗期叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量，初步比较3种新疆野核桃在干旱胁迫下的生理反应差异，确定其适生水分范围，为新疆野核桃的进一步保护性开发研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验处理

采集种子表型特征差异明显，在新疆野核桃沟存活株数较多，且在各生长区域有一定数量分布的卵圆形、尖嘴形、心形3种类型新疆野核桃种子，单株取样，按不同类型混合；当年11月播种于花盆内，并在位于新疆乌鲁木齐县水西沟的阳光温室内培养；次年7月，每个类型随机选取50株盆栽1年生新疆野核桃实生幼苗，在新疆农业大学林木遗传育种实验室内进行持续自然干旱处理，处理前浇足量水，使每株幼苗土壤水分达到相对饱和状态，后直到试验结束不再浇水；每隔 5d，即分别在试验后0(刚灌完水，CK)、5、10、15、20、25d及复水10d，于08：00随机选取新疆野核桃实生幼苗中上部的成熟叶片，测定叶片的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性及丙二醛含量等指标。

1.2 各指标的测定方法

1.2.1CAT活性 参照邹琦的方法[11]进行：新疆野核桃幼苗叶片提取酶液0.05mL，加入1.5mL磷酸缓冲液，再加 1mL蒸馏水；逐管加入0.1mol/LH2O20.45mL，迅速倒入石英杯中，测定波长为240nm处的吸光度，每隔1min读数1次，共读数5次；计算CAT活性，公式为：

CAT活性=(D240 nm×VT)/(0.1×V1×t×m)。

式中：D240 nm为波长240nm的吸光度；VT为提取酶粗液的总体积，mL；V1为测定时用的酶体积，mL；t为开始加H2O2到最后1次的读数时间，min；m为叶片鲜质量，g。

1.2.2POD活性 参照李合生等的方法[12]进行：试管中依次加入磷酸缓冲液2mL、2%H2O20.2mL、愈创木酚 0.5mL，最后加入新疆野核桃幼苗叶片提取酶液0.1mL，水浴锅中34 ℃保温1min；取出，测定波长为470nm处的吸光度，每隔0.5min读数1次，共读数5次；计算POD活性，公式为：

POD活性=(ΔD470 nm×VT)/(0.01×VS×t×m)。

式中：ΔD470 nm为反应时间内吸光度的变化；VT为总提取液体积，mL；m为叶片鲜质量，g；VS为测定时使用的酶液体积，mL；t为反应时间，min。

1.2.3SOD活性 参照李合生等的方法[12]进行：试管中依次加入磷酸缓冲液1.5mL、甲硫氨酸(Met)0.3mL、氮蓝四唑(NBT)0.3mL、乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)0.3mL、0.25mL蒸馏水、稀释5倍的核黄素0.3mL，最后加入新疆野核桃幼苗叶片提取酶液0.05mL，置于4 000lx日光下反应 6min，以暗处理的样品为空白对照，测定波长为560nm处的吸光度，计算SOD活性，公式为：

SOD活性=(D0-Ds)×VT/(0.5×D0×V1×t×m)。

式中：D0为空白对照的吸光度；Ds为样品管的吸光度值；VT为样品液的总体积，mL；m为样品鲜质量，g；V1为测定时提取液用量，mL；t为反应时间，min。

1.2.4MDA含量 称取样品2g，加入10%三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加入10%三氯乙酸8mL进一步研磨，匀浆 4 000r/min离心10min；吸取上清液2mL，加入0.6%硫代巴比妥酸溶液2mL，以加入2mL蒸馏水为对照，混匀，沸水浴反应15min；迅速冷却，离心，取上清液，分别测定波长为532、600、450nm处的吸光度，计算MDA含量，公式为：

MDA含量=[6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56×D450 nm]×V/m。

式中：D532nm、D600 nm、D450 nm分别为波长532、600、450nm处的吸光度；V为样品液的总体积，mL；m为样品鲜质量，g。

1.3 统计分析

采用Excel2010、SPSS19.0软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下新疆野核桃叶片CAT活性的变化

由表1可知，干旱胁迫处理0～10d，3种类型新疆野核桃叶片CAT活性增长较为缓慢；胁迫处理10～20d，3种类型新疆野核桃叶片CAT活性增长较为迅速；胁迫处理20d时，卵圆形、尖嘴形、心形野核桃的CAT活性分别为235.33、151.66、131.00U/(g·min)，其中卵圆形野核桃的CAT活性显著高于其他2个类型野核桃(P<0.05)；卵圆形、尖嘴形野核桃叶片的CAT活性在胁迫处理20d时达到最大值，胁迫处理25d时急剧下降，而心形野核桃在胁迫处理25d时达到最大值，为170.66U/(g·min)，心形野核桃的CAT反应受干旱胁迫时间相比前两者较长；复水10d，尖嘴形、卵圆形野核桃叶片的CAT活性分别为52.00、34.66U/(g·min)。

表1 干旱胁迫下3种类型新疆野核桃叶片的CAT活性

注：数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下表同。

2.2 干旱胁迫下新疆野核桃叶片POD活性的变化

由表2可知，干旱胁迫处理0～5 d，3种类型新疆野核桃叶片的POD活性变化不大，在50 U/(g·min)左右，呈缓慢上升趋势；胁迫处理5～20 d，3种类型野核桃叶片的POD活性急剧上升，其中心形野核桃叶片POD活性增长幅度相对最大，其次是卵圆形，尖嘴形野核桃叶片POD活性增长相对最慢；胁迫处理20 d时，3种类型野核桃叶片POD活性相互间有显著性差异(P<0.05)；胁迫处理20～25 d，心形野核桃叶片POD活性依然呈增长趋势，且在胁迫处理25 d时达到峰值，为222.80 U/(g·min)，而卵圆形和尖嘴形野核桃叶片POD活性均呈下降趋势；胁迫处理25 d时，卵圆形野核桃叶片的POD活性降到2.00 U/(g·min)；心形野核桃叶片POD活性在复水10 d时相对最低，为7.40 U/(g·min)。

表2 干旱胁迫下3种类型新疆野核桃叶片的POD活性

2.3 干旱胁迫下新疆野核桃叶片SOD活性的变化

SOD是一种重要的活性氧清除酶，当外来胁迫导致活性氧大量产生时，SOD能及时有效清除自由基，保护细胞免受活性氧胁迫的伤害[13]。由表3可知，干旱胁迫处理0～10 d，尖嘴形、心形野核桃叶片的SOD活性增加速度相对较慢，而卵圆形野核桃叶片的SOD活性增长速度相对较快；胁迫处理5 d时，卵圆形野核桃叶片SOD活性显著低于其他2种类型(P<0.05)；胁迫处理10～20 d，卵圆形和尖嘴形野核桃叶片的SOD活性增长非常接近，有几乎相同的变化趋势，而心形野核桃叶片的SOD活性增长速度稍为缓慢；卵圆形野核桃叶片的SOD活性在胁迫处理20 d时达到峰值，而其他2种类型野核桃在胁迫处理25 d时达到峰值；复水10 d，卵圆形、尖嘴形野核桃叶片的SOD活性有明显的下降。

表3 干旱胁迫下3种类型新疆野核桃叶片的SOD活性

2.4 干旱胁迫下新疆野核桃叶片丙二醛含量的变化

植物体内的膜脂过氧化产物积累与植物受逆境伤害程度呈正比关系，植物受伤害程度越小，则丙二醛积累量越小；反之，则丙二醛含量越大[14]。由表4可知，随胁迫天数的增加，卵圆形、尖嘴形野核桃叶片的丙二醛含量呈先上升后下降趋势，而心形野核桃叶片丙二醛含量呈持续上升趋势；干旱胁迫处理15～20 d，卵圆形、尖嘴形野核桃叶片的丙二醛含量呈明显上升趋势，且在胁迫处理20 d时达到峰值；心形野核桃叶片丙二醛含量在胁迫处理25 d时达到峰值，为 26.66 μmol/g，与其他2个类型野核桃叶片丙二醛含量相比有显著性差异(P<0.05)；复水10 d，3种类型野核桃叶片的丙二醛含量都有不同程度的下降。

表4 干旱胁迫下3种类型新疆野核桃叶片的MDA含量

3 结论与讨论

野生植物资源是重要的遗传资源，是未来人类能够利用的资源[8]。新疆野核桃在我国主要分布于新疆维吾尔自治区伊犁巩留野核桃沟内，是极为珍稀的野生资源，对育种和栽培核桃的起源、演化研究具有重要的价值。王肇延研究表明，新疆野核桃对生存的环境要求较高，而新疆气候干燥、降水量少的特点时刻威胁着新疆各类野生果树的生存[10]。因此，研究新疆野核桃在干旱环境下的生理适应性反应，对新疆野核桃未来的研究利用有着重大意义。

植物保护酶系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等，相互间可协同作用，使氧自由基维持在一个较低的水平上，从而防止氧自由基对生物体造成伤害，目前已广泛用于植物对逆境的反应机制研究[15]。过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，是生物防御体系的关键酶之一，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系；过氧化物酶是植物体中活性较高的一种酶，与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，可作为组织老化的一种生理指标。超氧化物歧化酶是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶[16]，是生物体内一种很重要的抗氧化酶类，有很好的科研意义和应用价值[17]。试验结果表明，卵圆形、尖嘴形2种类型的新疆野核桃叶片CAT活性在干旱胁迫处理20 d时达到最大值，后开始下降，心形新疆野核桃叶片CAT活性在干旱胁迫处理25 d时达到最大值，说明心形野核桃抗旱能力较强；3种类型新疆野核桃叶片POD活性在胁迫初期呈缓慢增长趋势，说明植物对干旱胁迫有一个适应调节的过程，而其变化幅度大小说明植物调节能力的强弱；胁迫处理25 d至复水10 d，卵圆形野核桃叶片的POD活性继续上升，说明干旱胁迫程度已达到饱和，POD活性不再发挥作用；干旱胁迫初期，卵圆形野核桃叶片的SOD活性增加速度相对较快，其余两者增长速度较慢，植株通过体内SOD活性上升来抵御逆境，使植物不受或受到较小伤害；干旱胁迫期间，尖嘴形、心形新疆野核桃叶片SOD活性呈持续上升状态，表明这2种新疆野核桃有较强的抗旱性。

丙二醛是机体内脂质过氧化的最终产物之一，其含量高低可一定程度上反映植物受氧化伤害的程度[18-19]。本试验结果表明，干旱胁迫过程中，心形野核桃叶片的丙二醛含量呈上升趋势，直至复水10 d下降，而卵圆形、尖嘴形野核桃叶片的丙二醛含量呈先上升后下降趋势，胁迫处理20 d时达到峰值，说明心形野核桃的抗逆性较尖嘴形、卵圆形抗逆性强。

从整体来看，心形野核桃过氧化过程相对较慢，细胞膜稳定性较高，抗旱性较强，尖嘴形野核桃调节自身抗氧化酶活性的能力居中，而卵圆形野核桃参与渗透调节能力消耗相对较大，调节自身抗氧化能力相对较弱；3种野核桃抗旱性强弱依次为心形>尖嘴形>卵圆形。