不同收获期白刺花种子活力及干热胁迫对幼苗生长发育的影响

吴丽芳， 魏晓梅， 陆伟东， 李 通， 姚晴晴， 赵小丽

(1.曲靖师范学院生物资源与食品工程学院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云贵高原动植物多样性及生态适应性进化重点实验室，云南曲靖 655011)

白刺花(Sophoradavidii)为豆科(Leguminosae)槐属(Sophora)多年生落叶灌木，在我国主要分布于西北、华北、华东和西南地区，在云南昆明、玉溪、曲靖、红河、楚雄、大理、丽江、迪庆等州(市)海拔850～2 500 m的地区广泛分布。因其具有耐旱、耐贫瘠、根系强大、固氮能力强等特性，在喀斯特地区成为了水土保持的先锋树种。白刺花种皮具蜡质，内含胶质，不透水、不透气，硬实率高达81.9%[1]，若不经特殊处理，种子萌发率极低，不能正确指示实际发芽能力。徐本美等研究得出白刺花硬实种子活力高于非硬实种子，因此认为硬实是种子高活力的一种表现[2]。种子活力是决定种子或种子批在发芽和出苗期间的活性水平和行为的综合体现[3]，表现在发芽率、成活率、耐藏性、抗老化等方面[4]，其高低主要受遗传因素和环境条件的影响[5]。国内外学者在农作物如水稻[6]、大豆[7]、玉米[8]、小麦[9]上关于种子活力的研究多有报道，而有关白刺花种子活力方面国内除了徐本美等[2]早期研究过以外，目前尚见相关报道。本研究采用连续6年收集的白刺花种子，利用氯化三苯四氮唑(TTC)法研究白刺花种子活力，为丰富白刺花种子的特性提供理论基础。

高温干旱严重制约植物的生长发育，我国目前约有1/3的土地面积位于干旱、半干旱地区[10]。云南干旱现象几乎年年出现，只是出现的时段和影响程度不同。1997年至2006年对云南气候研究认为，云南高温干旱多出现于4—8月之间，如2005年5月云南省元阳县极端气温高达43.2 ℃，打破了1969年巧家县的42.7 ℃极端最高气温的历史纪录[11-13]。高温干旱协同的发生比单一的干旱或高温对植物生长和产量危害要大[14]。有研究报道，高温干旱影响了植物的叶片结构[15]、生理变化[16]、保护酶系统的防护[17]、光合作用和呼吸作用[18]、蛋白质变化等[19]。目前，对白刺花逆境的研究多侧重于干旱单因子的报道，而较少研究高温和干旱双因子胁迫对其生长发育的影响。通过研究不同采集年份的种子活力、发芽率及干热胁迫对幼苗生长早期形态、光合系统及生理生化的变化，旨在为种质资源收集保存及干热胁迫对幼苗的伤害提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别于2010年10月、2011年10月、2012年10月、2013年10月、2014年10月和2015年10月，在曲靖师范学院校园里连续采集6年的白刺花种子，脱去外壳，剔除有虫害、干瘪的种子后，分选出比较大的种子保存于4 ℃低温冰箱中备用。

1.2 不同采收期白刺花种子活力测定

采用TTC法测定种子活力[20]：分别将不同采收期的白刺花种子浸泡24 h，剥离种皮露出种胚后进行染色，恒温箱中保温2 h，统计具有活力种子的百分率。

种子活力=有活力的种子数/测定种子总数×100%。

1.3 不同处理方法对白刺花发芽率试验

1.3.1 常规萌发处理 将白刺花种子用10%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗4～6次均匀放置于垫有双层滤纸的培养皿中，每皿50颗，共5次重复。

1.3.2 沸水浸种 用始温80 ℃的水浸泡种子1 d，浸泡过程中用振荡器振荡(70 r/min)以利于氧的吸收，然后用10%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗4～6次均匀放置于垫有双层滤纸的培养皿中，每皿50颗，共5次重复。

1.3.3 浓硫酸处理 浓硫酸(比重1.84)浸泡种子30 min，处理完之后流水下冲洗3 min，再用10%次氯酸钠溶液消毒 10 min，无菌水冲洗4～6次均匀放置于垫有双层滤纸的培养皿中，每皿50颗，共5次重复。

1.3.4 划破种皮 用解剖刀把种子划个小口，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗4～6次均匀放置于垫有双层滤纸的培养皿中，每皿50颗，共5次重复。

1.3.5 种子培养 在25 ℃恒温光照箱里暗培养，按照《国际种子发芽规程》第5天统计发芽势，第10天统计发芽率。

发芽势=5 d内发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽率=10 d内发芽种子数/供试种子数×100%。

1.4 干热胁迫下白刺花幼苗生长的生理生化的试验设计

1.4.1 白刺花幼苗的培育 以2014年收集的较大种子为试材，刀片划破种皮后，70%乙醇消毒2 min，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，无菌水冲洗4～6次后接种于不填加任何激素的MS固体培养基(0.7%琼脂，3%蔗糖)中，自然光照下培养45 d后，室温下炼苗5 d栽植于黑色塑料花盆中(花盆介质珍珠岩 ∶腐叶土 ∶红壤土=1 ∶1 ∶2)，每处理栽植6盆，每盆栽种3棵，栽植好后将花盆放入实验室靠阳光直射的窗户边，当幼苗成活后转至校园理学楼2楼楼顶，常规浇水，生长2个月后进行干热胁迫处理。

1.4.2 试验设计 干热胁迫前5 d将植株浇足水，然后将其放入人工气候箱进行胁迫，胁迫期间不再浇水，胁迫温度设定为25 ℃(T1)、30 ℃(T2)、35 ℃(T3)，25 ℃下正常浇水为对照(CK)，光照度8 000 lx，光—暗周期14 h—8 h，分别在胁迫2、5、8 d，胁迫复水后5 d测定相关指标。

1.4.3 试验测定指标及方法 叶片相对含水量：参照Chartzoulakis等的方法[21-22]，各处理分别任取5株植株上部的10张叶片，立即称鲜质量(mf)，然后置于水中，黑暗4 ℃条件下浸泡24 h至饱和状态，称量饱和鲜质量(mt)，最后将叶片于80 ℃烘干，称取干质量(md)。植物叶片相对含水量(RWC)计算公式如下：

RWC=(mf-md)/(mt-md)×100%。

叶绿素含量：参照李合生的方法[20]，每一处理任取5株植株上的叶片，蒸馏水冲洗干净，称取0.1 g叶片研碎，用80%丙酮低温黑暗下浸泡至完全变白，提取过滤液，用紫外分光光度计于波长646、663、470 nm下测定叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Car)的吸光度，计算Chla、Chlb、Car的含量和Chla/Chlb以及Chl/Car的含量比值。

丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸比色法测定，具体过程参照上海植物生理研究所主编的《现代植物生理学实验指南》[23]。

可溶性糖含量参照李合生的蒽酮比色法[20]测定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性：参照李合生的氮蓝四唑光还原法[20]测定。

1.5 试验数据的统计

使用SPSS 13.0和Excel 2003进行试验数据分析，以0.05作为差异的显著性水平。

2 结果与分析

2.1 不同采收期白刺花种子活力变化

TTC测定种子活力依据种子呼吸代谢过程中的脱氢酶与TTC反应生成红色的三苯甲腙(TTF)，代谢物质越多，颜色越深，表明代谢强度越强。由图1可以看出，2010年采收的白刺花种子活力最低，仅67.4%，2015年采收的种子活力最强，为76.6%，6年间种子活力下降仅9.2百分点。2010—2012年采收的种子活力缓慢上升，2014—2015年采收的种子活力上升较快。通过方差分析发现，各年间采收的种子活力没有显著差异。

2.2 不同采收期白刺花种子的发芽势和发芽率

白刺花种子不透水、不透气，种皮有蜡质，具强休眠特性，须经特殊处理才能体现白刺花种子的种用价值。图2和图3分别为白刺花的发芽势和发芽率，发芽率的大小随处理方法的不同差异较大。从图3可以看出，划破种皮能使发芽率提高至74.67%，而常规发芽方法其发芽率仅10%左右，在不同的处理中，发芽率的由高到低分别是划破种皮>浓硫酸处理>沸水处理>常规萌发。不同年际间采收的种子，发芽率也有所差异，其中划破种皮处理2010年采收的发芽率最高，相比而言，2015年采收的发芽率最低，这可能是由于白刺花种子在低温储藏过程中，部分有破除休眠的作用。种子发芽势反映了种子出苗的整齐性及幼苗生长的质量问题，通过试验观察白刺花的种子发芽势在前4 d内均不高，且在试验过程中同时也观察到，最先吸涨的种子不发芽，经过3～4 d直至更长时间的充分吸涨后，白刺花种子才能萌发，这一现象表现出了硬实种子萌发的特性。从图2和图3中可以看出白刺花种子的发芽势和萌发率受不同的萌发处理影响比较大，与种子活力无关，且不同年份采收的种子除了划破种皮处理外，其余处理没有明显差异。

2.3 干热胁迫下白刺花叶片含水量的变化

叶片相对含水量反映了植物生长过程中生化代谢强弱。生长旺盛时期，植物体内的含水量高，休眠期或停止生长时，含水量低。表1所示的是高温干旱胁迫下白刺花叶片含水量的变化。当胁迫处理2 d时，对照处理与25 ℃干旱处理差异不显著，30 ℃及35 ℃的高温干旱处理与对照相比差异显著。从植株外形看，植株长势良好，叶片没有太大变化，这可能也证明了白刺花具有一定高温和干旱的忍耐力。胁迫5 d，不同高温干旱处理下，均有显著性差异，与对照相比，叶片含水量分别下降了9.4%， 13.6%和19.1%。胁迫8 d，明显看到叶片萎蔫，卷曲皱缩，甚至有部分叶片外周干枯，与对照相比，均具有显著性差异，且含水量分别下降23.2%、32.3%和48.3%。几种处理过的叶片复水后5 d含水量也具有显著性差异，含水量与胁迫8 d相比有所升高，但与对照相比，仍未完全恢复，说明当高温及干旱超过限度后，植物一经损伤恢复起来有一定困难。

表1 干热胁迫下白刺花叶片含水量的变化

注：不同小写字母表示在0.05水平时的差异显著。下表同。

2.4 干热胁迫下白刺花光合色素含量的变化

表2为干热胁迫下白刺花叶绿素含量的变化，从表中可以看出胁迫2 d Chla、Chlb和Car的含量随胁迫温度的增加有上升趋势，可能是由于短期干热胁迫时，叶片含水量减少，而白刺花本身对干热的适应能力加速了光和色素的合成，从而能补偿植物光合作用。但Chl/Car反而下降，也就是说叶绿素a和叶绿素b合成的速率没有胡萝卜素合成的速率快。胁迫5 d，Chla、Chlb、Car含量和Chl/Car的变化没有规律性，Chlb之间没有差异，Car和Chl/Car之间差异显著，很可能是植物在适应环境的变化中，体内自身代谢合成与呼吸消耗的补偿和超补偿能力紊乱所致。在干热胁迫8 d后与胁迫5 d处理相比，各指标有所变化，除Chl/Car外均呈下降趋势，Chla、Chlb之间差异显著，Car的含量CK与T1有显著差异，但T2和T3没有差异，尤其高温35 ℃时，下降速率更快，这可能是因为持续的干热情况下，白刺花整个的色素合成系统受损。复水处理后，白刺花光合色素恢复不一，且各含量之间多没有显著差异。

表2 干热胁迫下白刺花叶绿素含量的变化

2.5 干热胁迫下白刺花MDA含量的变化

植物遭受逆境胁迫时，MDA会与细胞内的物质发生反应，造成细胞膜系统发生变化，因此MDA含量的变化是细胞质膜损伤的指标之一。从表3可以看出，随着胁迫时间的延长和胁迫强度的增加，MDA的含量增加，当胁迫2 d时，25 ℃下MDA含量增加的不多，仅增加了16%，当胁迫5 d时，各处理间均有显著差异，且与对照相比，MDA分别增加了79.17%、120.83%和191.67%，增幅较大；胁迫8 d时，与对照相比，MDA分别增加了150.00%、188.46%和219.23%，增幅较胁迫2 d和胁迫5 d大，说明在高温干旱下，随时间的延长，膜脂过氧化反应持续加重，植物细胞质膜受到不同程度的损害。复水过后，细胞MDA含量虽与胁迫5 d、胁迫8 d相比有所减缓，但与胁迫2 d相比仍偏高，说明白刺花对短期干热胁迫有一定抵抗力，超过一定时间后，细胞质膜会受到损伤。

表3 干热胁迫下白刺花丙二醛含量的变化

2.6 干热胁迫下白刺花可溶性糖含量的变化

可溶性糖是植物参与渗透调节维持细胞膨压的物质之一，是有机碳的主要储存形式。从表4可以看出，干热胁迫下，随着胁迫时间和胁迫强度的递增，可溶性糖含量也增加。在干热胁迫2 d，各高温处理下可溶性糖含量逐渐增加。胁迫5、8 d，可溶性糖含量明显上升，与对照相比，处理5 d的T3和处理8 d的T3可溶性糖含量分别增长了120%和160%。

表4 干热胁迫下白刺花可溶性糖含量的变化

2.7 干热胁迫下白刺花SOD活性的变化

SOD是植物体内清除活性氧自由基的保护酶之一，它可以通过与过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)共同作用清除超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢来减少活性氧对细胞膜的伤害、减轻膜质过氧化和稳定膜的透性。在植物正常生长过程中，植物体细胞内活性氧的产生和清除系统处于相对稳定的平衡中，当植物受到逆境的胁迫时，活性氧会大量积累，植物保护酶的防御系统也相应地变化。如表5所示，随着干旱和温度的加剧，SOD活性呈上升趋势，各处理间具有显著差异，尤其当胁迫8 d时上升速度更快，复水后SOD值又开始下降。

表5 干热胁迫下白刺花超氧化物歧化酶活性的变化

3 结论与讨论

种子活力某种程度上代表了植物种胚的生长潜力，早期人们定义种子活力为种子在发芽和出苗期间的活性强度及特殊的综合表现，认为高活力的种子发芽早，出苗整齐，对不良环境的适应能力强，它是种子质量好坏评价的重要指标之一。种子活力的高低受其本身的遗传因素、贮藏环境和发芽环境条件影响。其中就遗传方面，发育过程中贮藏物质的积累是种子活力形成的基础，随着种子的生长发育、成熟，体内蛋白质、淀粉的积累，种子活力逐渐提高。白刺花由于种皮不透水、不透气，存在严重的硬实现象，若不经特殊处理，种子萌发率非常低。国际种子检验规程(ISTA 2005)[24]以及我国国家质量技术监督局发布的牧草种子国家标准(2001年)、林木种子国家标准(2000年)和农作物国家标准(1996年)[25]将硬实纳入“未萌发种子”(ungerminated seeds)范畴。此类划分对于硬实种子而言，制约了它的发育特性。早期人们研究就得出硬实种子的高活力特性具有普遍性，硬实程度的强弱与种子活力的高低呈正相关[26]。本研究中，种子采收越早，活力越低，可能是白刺花种子储藏过程中有破除休眠的特性，致使代谢活性变化所致。但从6年的采收间隔而言，种子活力下降仅9.2百分点，年份间的变化没有显著差异，这充分证实了硬实种子高活力的特性。

不同处理方法对白刺花种子萌发率的影响有很大的差异，浓硫酸处理主要是利用强酸的腐蚀性作用使种皮充分吸涨，沸水处理也是促使种子的吸涨作用。在一些报道中，白刺花的种子萌发率最高的是砂纸摩擦处理，可以使发芽率达到70%以上[27-28]。砂纸摩擦与划破种皮一样，都是直接破除种皮吸水障碍，2种处理方法各有优劣，划破种子不利于大规模的使用，砂纸摩擦容易损伤种子。规模化的生产中，建议采用沸水处理，简单方便。

水是生命活动过程中不可缺少的，它参与了植物的代谢过程，一般来说植物组织含水量的多少与其生命活动强弱有平行关系，在一定范围内组织的代谢强度与其含水量成正相关。本研究中随着干热胁迫时间的延长和胁迫温度的增加，叶片相对含水量降低，而短时期的胁迫下，白刺花的光合色素含量反而升高，这可能是因为白刺花叶片含水量降低致使叶片缩小或卷曲而要提高光合作用的情况下所形成的一种补偿作用。

MDA作为植物细胞膜不饱和脂肪酸发生过氧化作用的最终产物，含量高低反映细胞膜受伤害的程度，本研究中随着胁迫强度的增加MDA的含量也递增，尤其当胁迫8 d时上升最快。可溶性糖作为参与渗透调节维持细胞膨压的重要物质，干热胁迫下，植物体内的可溶性糖会大量积累，积累量越大，抗性越强。有研究认为，成熟白刺花叶片的抗氧化酶活性较高，其干旱适应性越强[29]。在植物的抗氧化系统功能所能容许限度内，干旱胁迫强度与抗氧化酶活性存在明显的剂量效应。本研究中随着干热胁迫强度的加大，SOD活性也逐渐递增，说明白刺花对干热胁迫具有较强的耐受能力。