NaCl胁迫下zma-miR059的表达及其抗盐性分析

王 红， 毋若楠， 王争艳， 杨成成， 武永军

(西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵 712100)

土壤盐渍化导致环境退化，严重影响着作物的生长及产量。土壤中盐离子浓度过高会造成植物根系吸水困难，使植物体内含水量下降，膨压降低，引起植物细胞脱水死亡，甚至影响植物自身的生存[1]。目前，我国大约有0.33亿hm2盐碱地，而大量农作物耐盐性差，在盐碱地中无法种植，因此，如何提高农作物的耐盐性，对扩大我国耕地面积具有现实意义。

miRNAs是植物体内普遍存在的一类小分子非编码RNA，其长度在24 nt左右[2]。miRNAs广泛参与植物的生长发育、形态建成、果实发育、对生物和非生物胁迫的响应等过程[3]。研究发现，拟南芥[4]、玉米[5]中都存在响应盐胁迫的miRNAs。目前研究miRNAs功能的方法有过表达和基因沉默等。向娟等发现，在拟南芥中过表达番茄的miR397能够增强拟南芥的抗旱性[6]。2014年Gu等构建了沉默miR165/166的STTM(short tandem target mimic，即短串联靶标模拟)载体，导致转基因棉花中靶标基因的表达量明显上升[7]。

当土壤环境中盐离子浓度较高时，会破坏植物细胞内的离子平衡，引起膜功能异常，代谢活动减弱，从而影响生长[8]。当植物受到非生物胁迫时，活性氧积累且高度活跃，刺激植物通过抗氧化酶级联反应来清除活性氧[9]，使植物体内清除活性氧相关酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)、过氧化物酶(peroxidase，简称POD)、过氧化氢酶(catalase，简称CAT)等活性升高[10-11]。此外，在胁迫下，细胞膜会发生膜脂过氧化，产生丙二醛(malonaldehyde，简称MDA)，因此，可以通过丙二醛了解膜系统受伤害的程度[12]。保护酶活性及MDA含量已被广泛用来衡量植物受胁迫的程度。

笔者所在实验室在之前利用高通量测序研究了NaCl处理下玉米miRNAs的表达，发现zma-miR059的表达量在NaCl胁迫下显著上升。因此本研究以先玉335为试验材料，试图明确zma-miR059与盐胁迫的关系，以期为从转录后调控角度改进植物的耐盐性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 玉米品种和接种的菌株 玉米品种为先玉335，载体pOT2-Poly-cis、pFGC5941-PacI和农杆菌GV3101为笔者所在实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理和样品采集 将玉米种子进行消毒、萌发处理，当玉米芽长到2 cm时，用棉花包裹种子，留出根部，插入自制的玉米水培盆小孔中，每天用通气泵通气3次。用蒸馏水培养3 d后换Hoagland培养液培养至三叶期，挑出长势一致的玉米幼苗进行处理。分根处理(将玉米根系分为大致相等的2个部分)：将2个部分的根分别放入正常的Hoagland培养液和含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培养液中。全部根系NaCl处理：将玉米根系全部放入含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培养液中。对照：将全部根系放入不含NaCl的Hoagland培养液中，培养2 d后，取样进行试验，每个处理设置3个重复。

培养条件：光—暗周期为15 h—9 h，昼—夜温度周期为28 ℃—20 ℃。

1.2.2 RNA提取和反转录 用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取叶片和根系总RNA。提取RNA后用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，上海)进行反转录，严格按照试剂盒说明书进行操作。反转录参照Chen等发明的stem-loop RT-PCR，设计反转录引物：5′-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAC GATC-3′(5′末端是44个固定碱基，3′末端的8个碱基与miRNA成熟体的3′端互补配对)[13]。反应体系为20 μL：2.5 μL 总RNA、4 μL反应缓冲液、1 μL反转录引物、2 μL MgCl2、1 μL dNTPs、1 μL RNA酶抑制剂、1 μL 反转录酶，7.5 μL 水。反应条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min。

1.2.3 实时定量PCR 实时荧光定量PCR采用Promega公司的GoTaq®qPCR Master Mix，操作严格按照说明书进行。选择18S rRNA为内参，zma-miR059和内参的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反应体系为 20 μL：10 μL 2×GoTaq®qPCR Master Mix，7.4 μL水，各 0.3 μL 上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。在65～95 ℃，每升高0.5 ℃采集1次荧光，生成溶解曲线。每个样品设置3个重复，阴性对照以ddH2O为模板。表达量采用相对定量2-ΔΔCT法计算。

表1 实时定量PCR引物

1.2.4 SOD、CAT、POD活性及MDA含量的测定 参照高俊凤的方法进行CAT、SOD、POD活性和MDA含量的测定，均为鲜质量活性或含量[14]。

1.2.5 zma-miR059 STTM表达载体的构建 zma-miR059的序列为5′-ATCATGGCAGTGAGATCGTCG-3′，参照Yan等的方法[15]设计zma-miR059的STTM序列，整段序列如下：5′-CATTTGGAGAGGACAGCCCCGACGATCTCATAGCTG CCATGATGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTA AAGAAGAAGAATCGACGATCTCATAGCTGCCATGATGGTACG CTGAAATCACCAG-3′。根据上述序列设计引物，构建STTM-zma-miR059表达载体，引物序列详见表2。

表2 构建STTM-zma-miR059的引物

以pOT2-Poly-Cis质粒为模板，PCR扩增STTM(KOD-Plus-Neo，日本)，对PCR产物进行回收纯化[天根生化科技(北京)有限公司]，用Swa[New England Biolabs(NEB)公司，美国]酶切产物，4 ℃过夜自连，转化TOP10感受态细胞[天根生化科技(北京)有限公司]，用卡那霉素(Kan)筛选，选择阳性菌落以STTM-F、STTM-R为引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，进行BLAST比对。

以连接成功的pOT2-STTM为模板，PCR删除复制起始位点，将产物回收纯化，用PacI[New England Biolabs(NEB)公司，美国]酶切pFGC5941-PacI和PCR片段，为了防止载体自连，用pFGC5941-PacI酶切120 min后再在体系中加入1 μL碱性磷酸酶(NEB，USA)处理30 min，纯化，4 ℃过夜连接，转化TOP10感受态细胞，筛选重组载体pFGC5941-STTM，选择阳性菌落，以STTM-F、STTM-R为引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，进行BLAST比对。测序验证正确后用液氮速冻法将重组质粒转化到农杆菌GV3101中。

2 结果与分析

2.1 NaCl处理对zma-miR059表达的影响

由图1可以看出，NaCl胁迫下玉米叶片、根系中的zma-miR059表达量均明显上升。全根NaCl处理下，叶片表达量是对照叶的3.71倍，根系表达量是对照根系的3.75倍。zma-miR059在分根NaCl处理下的叶片和盐处理侧根系中的表达水平也上升，但没有全根NaCl胁迫下的上升明显。分根NaCl处理组叶片的表达量比对照叶片上调了120%，盐处理侧根系的表达量比对照根系上调了85%，水处理侧根系的表达量与对照根系相当。结果显示，在NaCl胁迫下zma-miR059的表达量明显上升，与前期高通量测序结果一致，进一步表明zma-miR059是一个新的与NaCl胁迫相关的miRNA。

2.2 NaCl处理对玉米SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影响

如图2-A所示，用NaCl处理后，玉米幼苗的叶片和根系中SOD活性均有所提高。NaCl处理对叶片中SOD活性的影响比对根系中SOD活性的影响更大；SOD活性在对照、分根NaCl处理和全根NaCl处理叶片中呈现出明显的上升趋势，且在全根NaCl处理的玉米叶片中SOD活性达到最大值；处理组根系中的SOD活性虽然也增加了，但没有叶片增加得明显。

NaCl处理能够在一定水平上影响幼苗的POD活性。如图2-B所示，NaCl处理后，叶片中的POD活性变化并不明显，其中分根NaCl处理呈现出微小的下降趋势。但是全根、分根NaCl处理的幼苗根系中POD活性均增加。

如图2-C所示，与POD、SOD的活性变化不同，NaCl处理后玉米幼苗根系和叶片中的CAT活性明显降低，特别是在全根NaCl处理的玉米幼苗中，CAT活性在其叶片中有明显降低，这与郑世英等的研究结果一致[16]。

如图2-D所示，NaCl处理对玉米幼苗的叶片和根系中MDA含量影响明显，全根NaCl处理的叶片中MDA含量是对照叶片中的4.25倍，分根NaCl处理的叶片中MDA含量是对照的2.06倍。全根NaCl处理的根系中MDA含量增加了 2.91 倍，分根处理的根系中MDA含量增加了2.01倍。经NaCl处理后，MDA含量在玉米幼苗叶片和根系的对照组、分根NaCl处理组及全根NaCl处理组中均呈现出明显的上升趋势。

2.3 zma-miR059-STTM表达载体的构建

按照第“1.2.5”节中描述的方法进行载体构建，对重组质粒进行菌落PCR或酶切鉴定，鉴定正确后通过测序最终确定STTM的序列。由图3可以看出，1、2、3泳道检测到的菌落PCR片段大小为134 bp，与预期大小一致，表明连接成功。由图4可以看出，酶切片段为删除pOT2-STTM复制起始位点的PCR片段，大小为2 837 bp，与PCR片段一样，说明 pFGC5941-STTM重组质粒连接成功。测序比对后显示序列正确，表明zma-miR059-STTM的表达载体构建成功。

3 讨论与结论

miRNA以调控靶标的方式在转录后水平参与植物对逆境胁迫的响应[17]。Ding等研究发现，用盐处理玉米根系时，miR166、miR319、miR395、miR399等表达水平显著改变[5]。本试验结果显示，用NaCl处理玉米幼苗时，叶片、根系的 zma-miR059表达量均升高，表明zma-miR059可能是玉米抗盐性相关的miRNA。此外，分根处理的玉米幼苗叶片和根系中zma-miR059的表达量低于全根NaCl处理，表明分根处理能够在一定程度上缓解玉米的胁迫情况，从而影响 zma-miR059的表达量。

植物体内的SOD、CAT和POD等抗氧化酶是检测活性氧代谢的生物标志物[18-20]，MDA在植物受到伤害后产生，植物受外界胁迫越强，MDA含量越高[12，21-22]，因此MDA含量及保护酶活性可以用来评判植物对外界胁迫的抵抗能力。全根NaCl处理和分根NaCl处理后，玉米幼苗叶片、根系中的SOD、POD活性均增加，表明NaCl胁迫导致植物体内膜脂过氧化、活性氧积累，而SOD等保护酶活性的增强可以有效清除活性氧，提高对胁迫的抵御能力。分根NaCl处理的玉米幼苗酶活性增加程度明显低于全根NaCl处理，表明在NaCl浓度相同时，分根NaCl处理的膜脂过氧化程度低于全根NaCl胁迫，分根处理会在一定程度上缓解植物的膜脂过氧化水平。NaCl处理后，玉米幼苗的叶片、根系中MDA含量明显增加，分根NaCl处理的玉米幼苗中MDA含量均低于全根NaCl处理，因此可见全根NaCl处理比分根NaCl处理会更大程度地损害植物膜系统。zma-miR059在根中的表达量变化趋势与MDA含量、POD活性变化趋势基本相同，都是胁迫后上升，且全根NaCl处理比分根处理增加幅度更大，进一步说明 zma-miR059 与玉米抵抗盐胁迫相关。

Yan等构建miR165/166的STTM载体侵染拟南芥后，出现了植株叶片不规则、矮小、弯曲的表型[15]，与FranCo-Zorrilla等构建的TM载体[23]相比，Yan等构建的突变体沉默效率更高[15]。本试验表明，zma-miR059是1个与玉米盐胁迫相关的miRNA，为了进一步研究zma-miR059的作用机制，揭示其功能，笔者构建了STTM载体，并进行了农杆菌转化，下一步将获得STTM-zma-miR059转基因玉米，期望通过转基因玉米试验进一步明确zma-miR059与抗盐性的关系。